桂花己糖激酶基因家族成員的序列及表達分析

龐天虹，錢婕妤，付建新，顧翠花，張 超

（1. 浙江農林大學 風景園林與建筑學院，浙江 杭州 311300；2. 浙江農林大學 浙江省園林植物種質創新與利用重點實驗室，浙江 杭州 311300；3. 浙江農林大學 南方園林植物種質創新與利用國家林業和草原局重點實驗室，浙江 杭州 311300）

桂花Osmanthus fragrans是中國十大名花之一，深受人們喜愛。前人研究報道桂花花香主要成分為α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、芳樟醇及其氧化物、羅勒烯等揮發性物質[1]，而桂花花色主要成分是類胡蘿卜素化合物[2]。桂花的花香和花色是其最主要的觀賞性狀，與花香和花色相關次生代謝物質的合成與積累直接影響到桂花的觀賞品質。植物呼吸作用不僅提供植物所需的能量，一系列的中間產物還為多種次生代謝化合物合成提供原料，在植物體內有機物轉變方面起到樞紐作用。已糖激酶(hexokinase，HXK)具有己糖磷酸化功能，經HXK磷酸化的己糖才能進行植物呼吸代謝的糖酵解途徑，為植物生長和發育提供能量和中間代謝產物[3-6]。高等植物HXK基因以多基因家族形式存在[7-11]。擬南芥Arabidopsis thaliana的6個HXK家族成員中，AtHXK1～3能磷酸化葡萄糖[10]，其中AtHXK1還具有感知和傳遞己糖信號的功能[12-13]。AtHXK1在強光條件下對植物根、葉和花序的生長和發育有促進作用[13]。此外，擬南芥成花轉變[14]和種子萌發[15]、植物花青素積累[16]和脂肪族硫甙生物合成[17]等植物生命活動都與HXK介導的己糖信號轉導息息相關。目前，未見桂花HXK基因功能有關的研究報道。本研究基于桂花不同花色品種轉錄組數據篩選OfHXKs相關Unigene序列，分析不同OfHXKs基因家族成員核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列，并與其他物種HXK蛋白進行多重比對和進化樹分析，同時分析不同桂花品種不同發育階段花瓣以及不同組織中OfHXKs基因表達特征，為進一步揭示桂花不同OfHXKs基因成員功能奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇浙江農林大學桂花資源圃生長狀況良好的地栽桂花‘堰虹桂’Osmanthus fragrans‘Yanhong Gui’(YHG)、‘玉玲瓏’O. fragrans‘Yulinglong’(YLL)、‘金球桂’O. fragrans‘Jinqiu Gui’(JQG)為材料，依據桂花花序不同發育階段[18]，對這3個桂花品種頂殼期(S1)、鈴梗期(S2)、初開期(S3)、盛開期(S4)花瓣分別進行取樣，取樣時間均為10:00。同時還對‘堰虹桂’1年生莖、2年生莖、嫩葉、成熟葉和盛開時花序進行取樣，用于不同組織中OfHXKs基因表達分析。用液氮速凍暫存樣品，后存于-80 ℃冰箱。

1.2 主要試劑和儀器

RNA提取試劑盒采用RNAprep Pure Plant Kit(天根，北京)；反轉錄試劑盒使用PrimeScript? RT Master Mix(Perfect Real Time)(Takara，大連)；熒光定量試劑盒使用TB Green?Premix Ex Taq? Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(Takara，大連)。實時熒光定量PCR儀為 LightCycler?480 Ⅱ(Roche，德國)。

1.3 方法

1.3.1OfHXKs序列分析 從轉錄組中篩選得到HXK相關的Unigene序列，首先使用美國國家生物信息中心(NCBI)數據庫中的BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對得到的基因序列進行對比；利用ORF FINDER (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)尋找開放閱讀框；用DNAMAN 6.0軟件對不同品種相同HXK基因成員進行核苷酸相似性比較，使用‘堰虹桂’的4個HXK基因成員序列開展后續序列分析，包括應用Prot-Param在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)預測所編碼蛋白的分子量、理論等電點(PI)、不穩定系數、總平均親水性等；使用YLoc (https://abi-services.informatik.uni-tuebingen.de/yloc/webloc.cgi)進行亞細胞定位預測；使用SOPMA分析軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)對OfHXKs家族的蛋白序列進行二級結構預測分析，判斷目的基因的氨基酸殘基是否處于于α-螺旋、β折疊(或其他狀態)的二級結構；用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)預測OfHXKs的三級結構；應用SignalP 5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對信號肽進行預測；利用TMHMM在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測分析桂花蛋白的跨膜結構；使用NetPhos 3.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對桂花花瓣OfHXKs蛋白質磷酸化位點進行預測；采用MEGAX軟件中的鄰位相鄰法(neighbor-joining，NJ)進行同源聚類，建立系統發育樹，并采用Bootstrap法(重復1 000次)評估檢測系統進化樹。

1.3.2 總RNA提取與cDNA的合成 采用RNAprep pure Plant Kit(天根，北京)多糖多酚植物總RNA提取試劑盒按照說明書步驟提取各樣品的總RNA。使用紫外分光光度計和質量濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA濃度和質量。反轉錄體系為總RNA 1.0 μL，5×PrimeScript RT Master Mix(TaKara，大連)2.0 μL，無RNA酶雙蒸水7.0 μL，PCR反應的程序設定為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 1 min。反轉錄合成的cDNA儲存于-20 ℃備用。

1.3.3 熒光定量PCR 根據熒光定量PCR引物設計原則利用Primer Premier 5進行引物設計，以桂花OfACT為內參基因[19]，引物序列見表1。熒光定量PCR反應體系為：TB Green Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa，大連) 5.0 μL，上下游引物 (10 μmol·L-1)各 0.4 μL，cDNA 模板(反轉錄 cDNA 稀釋20 倍)2.0 μL，雙蒸水2.2 μL，每個樣品設置3個生物學重復。反應程序為兩步法：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃復性30 s，重復40個循環；然后以95 ℃持續5 s，60 ℃持續1 min，95 ℃持續15 s作為溶解曲線程序。

表1 OfHXKs基因表達分析所用引物序列Table 1 Primer sequences of OfHXK genes of O. fragrans

2 結果與分析

2.1 桂花花瓣 OfHXKs基因序列分析

根據桂花不同花色品種轉錄組Unigene序列分析，篩選得到4個HXK基因的同源基因(OfHXK1～OfHXK4)，3個品種中均含有這4個HXK基因的同源基因。利用DNAMAN對不同品種OfHXK1～OfHXK4核苷酸序列進行多序列比對，核苷酸序列相似性比較結果見表2。不同品種桂花OfHXK1、OfHXK3和OfHXK4基因核苷酸序列相似性均高于99%，而不同品種桂花OfHXK2基因核苷酸序列相似性為94.42%～98.26%。選擇‘堰虹桂’的OfHXK1～OfHXK4基因推測的氨基酸序列進行后續分析。

表2 桂花 OfHXKs核苷酸相似性比較表Table 2 Comparison of nucleotide sequences of OfHXKs in O. fragrans

利用DNAMAN對‘堰虹桂’OfHXK1～OfHXK4氨基酸序列比對。由圖1可知：不同OfHXKs間具有高度保守的結構域，均包含2個保守的磷酸化作用位點phosphate 1和phosphate 2以及1個底物結合位點sugar binding。預測OfHXK1與OfHXK2序列中均包含12個疏水通道和11個甘氨酸殘基，而OfHXK3包含11個疏水通道和10個甘氨酸殘基，OfHXK4則包含12個疏水通道和10個甘氨酸殘基。與其他序列相比，OfHXK4氨基酸序列在其C端的腺苷結合位點處多出11個氨基酸殘基(KNEGAS RSKMR)。

圖1 桂花OfHXKs氨基酸多序列比對圖Figure 1 Multiple sequence alignment of OfHXKs amino acid sequences

2.2 桂花花瓣OfHXKs蛋白質基本理化性質分析及其跨膜區域和二級結構預測

利用ExPASy protparam預測分析OfHXKs家族蛋白質序列的基本理化性質，了解相對分子質量、氨基酸組成、等電點(PI)、不穩定系數、總平均親水性等，結果見表3。以OfHXK1為例，該基因編碼的氨基酸數目為498個，蛋白質相對分子量為53 881.09 Da，理論等電點為5.41，分子式為C2387H3857N653O719S21，氨基酸組成有20種，含有負電荷殘基(Asp+Glu)66個，正電荷殘基數(Arg+Lys)53個，總平均疏水性為0.055，不穩定系數為47.03，故推測OfHXK1為穩定蛋白質。結果顯示：除OfHXK4為不穩定蛋白質外，其余均為穩定蛋白質。蛋白質信號肽預測使用SignalP在線軟件默認條件下對OfHXKs氨基酸序列N-端開始前70位氨基酸進行信號肽預測分析，結果顯示OfHXKs氨基酸序列均無信號肽存在。應用YLoc在線軟件進行亞細胞定位預測，結果顯示OfHXK1與OfHXK2均定位于細胞質中，而OfHXK3則定位于葉綠體，OfHXK4位于線粒體。

表3 桂花 OfHXKs 蛋白質基本理化信息Table 3 Information of OfHXK proteins in O. fragrans

使用TMHMM在線軟件分析桂花OfHXKs蛋白質可能的跨膜區域，結果顯示除OfHXK3外均具有跨膜區域(圖2)，OfHXK1、OfHXK2與OfHXK4分別在第7～24位氨基酸殘基、第9～28位氨基酸殘基和第5～24位氨基酸殘基處具有跨膜區域，因此判斷OfHXK1、OfHXK2與OfHXK4為跨膜蛋白質，而OfHXK3則不屬于跨膜蛋白質。

圖2 桂花OfHXKs蛋白質跨膜區段預測Figure 2 Prediction of transmembrane protein segment of OfHXKs

蛋白質的二級結構預測是為了判斷目的基因所編碼的氨基酸序列殘基是處于α-螺旋、β折疊還是其他狀態的二級結構。通過SOPMA在線預測分析，結果顯示桂花OfHXKs蛋白質二級結構主要以α-螺旋和無規則卷曲為主(表4)。使用SWISS-MODEL進行三級結構預測，結果顯示為圖3。

表4 桂花花瓣 OfHXKs 蛋白質二級結構預測Table 4 Secondary structures of OfHXK proteins in O. fragrans

圖3 桂花OfHXKs蛋白質三級結構預測Figure 3 Prediction of tertiary structures of OfHXK proteins in O. fragrans

2.3 OfHXKs氨基酸序列同源性和系統進化分析

通過NCBI在線數據庫比對，將4個桂花花瓣OfHXKs蛋白質序列分別進行同源性比對。Blastp比對結果顯示：OfHXK1與油橄欖Olea europaeaXP_022882495.1同源性為96.39%，與芝麻Sesamum indicumXP_022882495.1同源性為88.15%；OfHXK2與油橄欖XP_022843013.1同源性高達97.80%；OfHXK3與油橄欖XP_022884724.1同源性高達96.16%，而與阿月渾子Pistacia veraXP_031283181.1以及粉紅鐘花Handroanthus impetiginosusPIM98716.1同源性分別為82.70%與85.45%；OfHXK4與油橄欖XP_022873061.1同源性達到95%以上，說明OfHXKs具有高度保守性。

利用MEGAX軟件對4個桂花花瓣OfHXKs蛋白質和從NCBI在線數據庫中找到的擬南芥HXKs蛋白質序列進行多序列比對，以100% bootstrap支持度構建系統進化樹進行分析，預測桂花OfHXKs的功能。由圖4所示：所選擇蛋白質序列分別為擬南芥AtHXK1(U28214)、AtHXK2(U28215)、AtHXK3(BT030472)、AtHKL1(NM_103929)、AtHKL2(NM_112895)和AtHKL3(NM_119945)。進化樹分析結果表明桂花花瓣OfHXK1與OfHXK2關系較近，而OfHXK3和OfHXK4分別聚集在不同小支，由此推斷OfHXKs蛋白質之間的功能可能具有一定區別。其中OfHXK1、OfHXK2與擬南芥AtHXK1、AtHXK2聚集在一支，而OfHXK3則與擬南芥AtHXK3關系較近，OfHXK4則與擬南芥AtHKL1、AtHKL2關系較近。

圖4 桂花花瓣OfHXKs和擬南芥AtHXKs蛋白質系統進化樹分析圖Figure 4 Phylogenetic tree of HXK proteins in O. fragrance and A. thaliana

2.4 桂花 OfHXKs基因表達分析

以桂花的頂殼期(S1)、鈴梗期(S2)、初花期(S3)和盛花期(S4)花序以及1年生莖、2年生莖、嫩葉、成熟葉的cDNA為模板，以桂花ACT基因為內參，進行實時熒光定量PCR，檢測不同品種桂花不同組織及不同發育階段的OfHXKs基因表達情況。由圖5可見：OfHXK1在‘堰虹桂’中的表達量呈現先上升后下降的趨勢；在‘金球桂’中同樣也在S3時期表達量最高，且顯著高于‘堰虹桂’與‘玉玲瓏’中相同時期的表達量(P＜0.05)；而OfHXK1基因在‘玉玲瓏’中的表達呈現先上升后下降的趨勢，于S2時期的表達量達到最高。OfHXK2基因在‘堰虹桂’中的表達量呈現逐步上升的趨勢，于盛花期的表達量最高；在‘金球桂’中，OfHXK2的表達量隨著開放過程未發生變化；OfHXK2的表達量在‘玉玲瓏’中呈現先上升后下降的趨勢。OfHXK3基因在3個品種的表達量隨著花開放呈現先上升后下降的趨勢，均在S2時期達到最高；S2時期‘金球桂’OfHXK3基因的表達量最高，‘玉玲瓏’次之。OfHXK4基因在‘堰虹桂’和‘金球桂’中的表達量也是先上升后下降的趨勢，在S2時期達到最高，而該基因在‘玉玲瓏’中表達量逐漸下降。S2時期‘金球桂’OfHXK4基因的表達量最高，‘堰虹桂’次之。

圖5 各品種桂花不同發育時期花序OfHXKs基因相對表達量變化Figure 5 Expression changes of OfHXK genes during different inflorescence of different O. fragrans cultivars

如圖6所示：在不同組織中，OfHXK1在嫩葉中的表達量最高，在成熟葉和盛花期花序中表達量次之，在1年生莖中的表達量最低；OfHXK2在盛花期花序中的表達量最高，在2年生莖中的表達量最低；OfHXK3則在莖中表達量最高，在成熟葉中的表達量極低；OfHXK4在成熟葉中的表達量最高，嫩葉中表達量次之，顯著高于1、2年生莖和盛開期花序中的表達量。

圖6 ‘堰虹桂’不同組織中OfHXKs基因表達量變化Figure 6 Expression changes of OfHXK genes during different tissues of O. fragrans ‘Yanhong Gui’

3 討論

HXK參與糖代謝的同時也參與己糖信號的感受和傳導[20-22]，由于其重要的生物學功能，關于HXK蛋白的研究也逐漸成為熱點[9,14,23-25]。本研究在桂花中發現HXK基因的4個同源基因，表明與其他植物一樣[6]，HXK基因也是以多基因家族形式存在桂花中，同一HXK基因家族成員序列在不同桂花品種中保守。桂花OfHXK1～OfHXK4基因推導的氨基酸序列均包含葡萄糖和ATP的結合位點，推測OfHXK1～OfHXK4均具有催化己糖磷酸化的功能。其中，OfHXK4氨基酸序列在其N端的腺苷結合位點處多出11個氨基酸殘基，這與擬南芥中HKL1和HKL2腺苷結合位點處多10個和6個氨基酸殘基的情況[10]類似。

進化樹表明OfHXK1、OfHXK2與擬南芥AtHXK1、AtHXK2聚集在一支，已知AtHXK1和AtHXK2具有催化己糖磷酸化的作用[10]，且具有糖感知和傳導的功能[26]，推測OfHXK1與OfHXK2同樣具有催化己糖磷酸化和感知并轉導糖信號的功能。OLSSON等[27]將植物HXK分為A類和B類，A類HXK具有質體信號肽，如AtHXK3；B類HXK具有N端膜錨定結構，如AtHXK1與AtHXK2。根據進化樹推測OfHXK1和OfHXK2可能屬于B類HXK，此外，核心的糖結合區域(LGFTFSFP-Q-L/I)在OfHXK1和OfHXK2序列中極其保守。OfHXK3與AtHXK3聚集于同一小支，擬南芥AtHXK3具有催化作用但無糖信號傳導功能[28]，推測無跨膜區域的OfHXK3屬于A類HXK，具有催化作用但無糖信號傳導功能。定位于線粒體中的擬南芥AtHKL1和AtHKL2屬于酶催化活性不高的HXK亞型，其氨基酸序列C端的腺苷結合位點處多出若干個氨基酸殘基[10]，而推測聚在一支的OfHXK4有相同特點。

桂花OfHXK1～OfHXK4基因在1年生莖、2年生莖、嫩葉、成熟葉和盛開時花序中均有表達。其他物種的大部分HXK基因，如擬南芥AtHXK1～AtHXK3、AtHKL1和AtHKL2[10]，番茄Lycopersicon esculentum LeHXK1～LeHXK4[11]， 水 稻Oryza sativa OsHXK2～OsHXK9[8]， 枸 杞Lycium barbarum LbHXK[29]和 蘋果Malus×domestica MdHXK1[30]，在被檢測的組織器官中均有表達。但是OfHXKs不同成員在不同組織中的表達水平呈現一定差異。OfHXK1和OfHXK2基因在葉和花中的表達量高于莖中，而OfHXK3基因在莖中的表達量最高，表明HXKs基因不同成員雖然磷酸己糖的功能存在冗余[10]，但是不同成員在桂花不同組織中發揮的主導作用存在差異。依據進化樹分析，OfHXK1與OfHXK2基因被推測具有糖信號感知和轉導功能，可能參與調控桂花花色和花香相關次生代謝物質的生物合成，這可能是OfHXK1與OfHXK2基因在花中的表達量較高的原因之一。

本研究分析了3個桂花品種不同發育階段花瓣中OfHXKs基因的表達情況，整體上‘金球桂’中OfHXKs基因表達量最高；隨著花開放的進程，OfHXK1、OfHXK3和OfHXK4基因的表達量呈現先上升后下降的趨勢。枸杞中研究發現，隨著枸杞果實的發育，HXK基因表達量在色變期達到峰值，成熟期表達量又下降[29]。牡丹Paeonia suffruticosa花瓣中的研究發現：隨著發育過程PsHXK1和PsHXK2基因在花瓣中的表達量呈現先增加后下降的規律，該變化規律與己糖含量有密切的關聯[24]。植物組織器官中的糖含量在一定范圍內增加可以促進HXK基因轉錄本和蛋白質的積累，植物體內己糖的磷酸化水平隨之增加；超過一定閾值后，植物體內糖含量增加則會抑制HXK基因轉錄和蛋白質的積累[5]。這也就解釋了大部分OfHXKs基因表達量先上升后下降的原因。桂花不同品種色素物質和香氣揮發物含量不同[1-2]，推測不同桂花品種對HXK己糖磷酸化和糖信號轉導作用的需求不同，此外HXK不同成員還有功能冗余的特點，因此OfHXK2基因在3個桂花品種花瓣中的表達模式不同。

4 結論

本研究根據桂花轉錄組Unigene序列分析，篩選得到4個HXK基因的同源基因。生物信息學分析結果表明4個基因分別編碼461～510個氨基酸殘基，同時推測OfHXK1～OfHXK4均具有催化己糖磷酸化的功能。進化樹分析表明OfHXK1和OfHXK2與擬南芥AtHXK1與AtHXK2親緣關系較近；OfHXK3與AtHXK3親緣關系較近；OfHXK4與AtHKL1和AtHKL2親緣關系較近。實時熒光定量PCR分析表明桂花OfHXK1～OfHXK4基因在1年生莖、2年生莖、嫩葉、成熟葉和花序中均有表達；OfHXK1、OfHXK3和OfHXK4基因隨著花開放的進程，整體上表達量呈現先上升后下降的趨勢，而OfHXK2基因在3個品種花序發育過程中表達模式不同。