基于CRISPR技術的新型冠狀病毒檢測方法與臨床轉化進展

張萬存，徐新秀，劉康博，張 飛，于志丹，李利鋒，張耀東，秦 紅，王煥民，張現偉

(1.鄭州大學附屬兒童醫院，河南省兒童醫院，鄭州兒童醫院，a.兒童腫瘤外科，鄭州市兒童惡性腫瘤精準診療重點實驗室，b. 河南省兒童遺傳代謝性疾病重點實驗室，中國 鄭州 450018;2.青島市市立醫院神經內一科，中國 青島 266011;3.河南省醫療器械檢驗所生物檢測室，中國 鄭州 450000)

冠狀病毒(Coronavirus, CoVs)為正鏈單鏈RNA病毒，基因組分子量約為30 000，是基因組較大的RNA病毒。冠狀病毒屬于套式病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)，可劃分為4個(α，β，γ和δ)冠狀病毒屬[1,2]。除目前肆虐全球的新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)外，已知對人類具有致病性的冠狀病毒有6種，分別為HCoV-OC43，HCoV-NL63，HCoVHKU1，HCoV-229E，SARS-CoV和MERS-CoV[3-6]，其中SARS-CoV與MERS-CoV具有高傳播性和致病性。截至2020年12月24日，根據世界衛生組織提供的數據，全球現存確診感染人數約21 943 537例，死亡人數約1 733 050例。目前，我國因SARS-CoV-2感染引起的新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)得到了良好的控制，但是從全球范圍看COVID-19疫情仍未有緩解趨勢。因為SARS-CoV-2傳播能力強，一旦發現1例COVID-19患者，須對該患者接觸人員進行SARS-CoV-2核酸檢測，會在短時間內需要大量的檢測試劑。因此，目前臨床上尤其在一些經濟不發達的偏遠地區，迫切需求一種可以快速、靈敏、特異性好的SARS-CoV-2現場檢測方法。

目前，核酸定性檢測作為COVID-19確診的標準方法，已廣泛應用于COVID-19臨床確診工作中[7]。高通量測序技術(NGS)和逆轉錄實時熒光定量PCR(RT-PCR)是兩種常用的SARS-CoV-2分子診斷方法[8-11]。mNGS最初用于SARS-CoV-2核酸序列的鑒定及其溯源分析，被認為是最重要的檢測方法之一。然而，由于其成本高、檢測時間長等原因，限制了其大規模的臨床應用，不適合用于大規模篩查COVID-19[11，12]。RT-PCR檢測方法相比于基于mNGS的方法速度更快、成本更低，然而，該技術對設備及人員要求比較高，這阻礙了其在實驗室資源落后條件下的使用，并且通量低。此外，目前市售RT-PCR試劑盒質量不均，靈敏度在45%至60%。因此，在感染的早期階段，可能需要重復檢測以達確診目的[13-17]。因此，RT-PCR和基于mNGS的核酸方法不適用于大規模人群中COVID-19的篩查。

成簇規律間隔短回文重復序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR)是一種能夠進行基因編輯的生物技術。近年來，CRISPR技術的等溫擴增方法已被用于核酸體外診斷中。相比于常規的變溫PCR，等溫核酸擴增的優勢在于其不需變溫即可進行核酸的擴增檢測，具有更快的擴增速度[18-23]。最新研究表明，基于CRISPR技術等溫擴增方法可以快速、高靈敏、高特異性地檢測SARS-CoV-2[24-26]。因此，基于CRISPR技術等溫擴增方法有望發展為一種強大而精確的核酸檢測工具檢測SARS-CoV-2，用于家庭和基層醫院COVID-19的篩查和監測。

1 基于CRISPR技術的核酸檢測方法原理

CRISPR和CRISPR相關核酸酶(Cas)是一種RNA指導的適應性免疫系統，包含可編程Cas內切酶和CRISPR RNA (crRNAs)，可用于核酸的識別和編輯。同時，CRISPR-Cas基因編輯系統作為“變革生物技術”斬獲了2020年諾貝爾獎。近年來，基于CRISPR-Cas系統的核酸檢測技術發展突飛猛進，主要依賴于該系統能在單鏈向導RNA指引下將 Cas酶(包括Cas12a，Cas12b，Cas13a，Cas13b和Cas14)與靶序列相結合并對其進行切割的技術原理[18,27-29]。目前廣泛用于核酸診斷的是CRISPR/Cas12系統和/Cas13系統，其中CRISPR/Cas12以DNA為靶點，對特異性DNA序列進行編輯。目前第一種檢測系統代表是Jennifer A. Doudna團隊開發的DETECTR(DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter)系統，通過RNA可以識別DNA，Cas12a酶切割單鏈DNA熒光報告分子，即可釋放熒光信號，這種信號既可以使用熒光儀器采集，又可以做成金標抗體的側向流層析試紙條，原理如圖1(a)。而張峰團隊開發的特異性高靈敏度酶報告解鎖(Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing，SHERLOCK)技術結合了各種CRISPR-Cas酶(如Cas13，Cas12a和Csm6)，基于核酸等溫擴增聯合CRISPR/Cas核酸檢測系統，可同時檢測多種核酸。在識別RNA/DNA靶序列后，活化的Cas蛋白參與附近非靶標RNA的側鏈切割，這使得Cas酶能夠在體外通過標記RNA/DNA的非特異性降解來檢測SARS-CoV-2核酸。該系統可實時、快速、特異地識別并能達到aM級別的敏感性，原理如圖1(b)[19]。

圖1 DETECTR方法檢測SARS-CoV-2示意圖(a)和SHERLOCK方法檢測SARS-CoV-2示意圖(b)Fig. 1 The schematic diagram of the DETECTR method for detecting SARS-CoV-2 (a) and the schematic diagram of the SHERLOCK method for detecting SARS-CoV-2 (b)

2 基于CRISPR技術的SARS-CoV-2核酸檢測優勢：高效、精準及可視化

臨床研究表明，住院患者的病毒滴度呈逐日波動狀態，且與疾病的嚴重程度無關[8,30]。對24個已出院的不同恢復期患者，在其再入院幾天后使用商業試劑盒檢測其標本中N基因和ORF1b基因的RNA均為陰性，其檢測限(0.5 Mcopies·L-1)較高。然而,使用SHERLOCK系統靈敏度可達0.1 Mcopies·L-1，結果顯示75%的標本S基因和41.6% ORF基因陽性，表明病人恢復期可能存在較低滴度的病毒載量[31]。因此，需要更敏感的核酸檢測方法來監控這些患者。Hou等人建立了一種CRISPR-nCoV方法對SARS-CoV-2檢測具有接近單拷貝的敏感性，且檢測時間短于RT-PCR[9]。Broughton等人開發了SARS-CoV-2側流檢測方法，該方法使用環介導等溫擴增反應(LAMP)和Cas12檢測同時進行逆轉錄和等溫擴增，在側向流層析試紙條上顯示，檢測限為10 Mcopies·L-1，檢測時間僅為30 min[18]。張鋒等人開發的基于CRISPR的SHERLOCK SARS-CoV-2核酸檢測技術，利用人工合成的SARS-CoV-2病毒RNA片段，可以在60 min內檢測20～200 aM范圍內靶序列[32]。因此，基于CRISPR的超靈敏方法，有望用于準確有效地監測和管理恢復期的COVID-19患者。

另一方面，對SARS-CoV-2進行特異性的核酸檢測對疫情防控至關重要。Hou等人使用所建立的CRISPR-nCoV方法檢測SARS-CoV-2和常見的呼吸道病原菌及病毒的DNA混合物，實驗結果表明，這些干擾樣本并沒有引起假陽性反應。同時，利用CRISPR-nCoV方法對52例SARS-CoV-2陽性樣本進行檢測，結果表明，該方法的敏感性為100%；對62例SARS-CoV-2感染陰性的受試者進行檢測，檢測結果均為陰性。因此，CRISPR-nCoV方法是一種有前途的新SARS-CoV-2檢測方法，具有高敏感性和特異性[9]。Broughton等人開發的基于CRISPR的側向流層析檢測方法(SARS CoV-2 DETECTR)，為SARS-CoV-2提供了一種快速且可視化的檢測方法。研究表明，利用SARS-CoV-2 DETECTR對6名RT-PCR檢測結果為陽性COVID-19患者的11份呼吸道拭子標本和來自流感患者、常見人類季節性冠狀病毒感染患者及健康獻血者的12份鼻咽拭子標本進行檢測，與RT-PCR檢測結果相比，SARS-CoV-2 DETECTR檢測方法對呼吸道拭子標本中SARS-CoV-2檢測的靈敏度為90%，特異度為100%，陽性預測值為100%，陰性預測值為91.7%[18]。與此同時，Patchsung等人最近的一項研究顯示，利用SHERLOCK方法檢測SARS-CoV-2的特異性為100%，敏感性為97%[18]。因此，基于CRISPR的方法有望用于SARS-CoV-2特異性檢測。

有效控制COVID-19的全球蔓延及傳播需要高效和準確的核酸檢測方法。然而，目前臨床SARS-CoV-2的檢測，需要將標本運送到指定的實驗室，對疑似COVID-19患者進行篩查和診斷，所需時間往往大于24 h。此外，臨床現有檢測方法通常需要昂貴的設備和訓練有素的人員[32,33]。這些都不利于對COVID-19疫情提供有效的監測。因此，在COVID-19全球快速蔓延的背景下，開發用于評估疑似感染的超靈敏、廉價、便攜式、不依靠專業人員和昂貴設備的檢測方法，對有效監測COVID-19和疫情的防控至關重要。

近年來，研究人員開發了多種等溫擴增方法，如重組酶聚合酶擴增[34-37]、環介導等溫擴增[38-41]、靶標循環非酶擴增[42-44]等，由于等溫擴增方法具有簡單、快速及成本低等優勢，已成為傳統PCR方法的替代品。然而，由于非特異性擴增信號的存在，將這些方法開發為臨床應用的可靠的即時診斷(point-of-care testing, POCT)仍存在挑戰[27,45]。然而基于CRISPR技術的等溫擴增方法可以很好地克服以上問題。Lucia等人開發了一種基于CRISPR-Cas12的診斷工具，用于檢測合成的SARS-CoV-2 RNA序列，這種檢測方法具有高的檢測靈敏度，可對靶標序列進行快速檢測，有望開發為便攜式可視化檢測方法[33]。Ding等人開發了AIOD-CRISPR雙Cas12a(簡稱AIOD-CRISPR)SARS-CoV-2檢測方法，引入crRNA對啟動雙Cas12a檢測，該方法簡單、快速、超靈敏，一步可視檢測SARS-CoV-2。因此，AIOD-CRISPR分析具有開發下一代即時分子診斷的潛力[46]。Joung等人開發了一種簡單的化學檢測方法，將擴增RNA的等溫PCR步驟和使用Cas酶檢測SARS-CoV-2特定序列的化學反應合并在同一個試管中進行，該方法命名為SHERLOCK test in a Pot (STOPCovid)，適用于在1 h內即時檢測SARS-CoV-2。STOPCovid檢測方法的靈敏度可與RT-PCR的SARS-CoV-2檢測方法相媲美，檢測限為100 copies。使用層析試紙條顯示，測試在70 min內得出結果，而使用熒光方法讀取信號，整個實驗僅需40 min。此外，在他們的研究中，利用STOPCovid和RT-PCR同時檢測鼻咽拭子的12個陽性結果和5個陰性結果，檢測結果完全一致。因此，STOPCovid可以極大地助力追蹤隔離工作，特別是在醫療資源匱乏地區，這對長期公共衛生安全和有效地重新開放社會有重大意義[47]。Broughton等研發的基于CRISPR-Cas12檢測試紙條可以在1 h內完成SARS-CoV-2的檢測[18]。張峰團隊在第一代的基礎上，簡化了RNA提取步驟，研制出STOPCovid.V2核酸檢測試劑盒，只需15～45 min就能獲得結果，同時，研究人員還開發了一款智能手機APP，幫助檢測人員對側流試紙的結果進行解讀[48]。Fozouni[24]等人利用CRISPR-Cas12和CRISPR-Cas13技術，開發了利用智能手機檢測SARS-CoV-2核酸的技術，從取樣到手機報告結果，僅需15～30 min。因此，基于CRISPR技術的檢測方法，有望開發為便攜式的可視化SARS-CoV-2檢測試劑盒。

快速、有效和準確地識別傳染性疾病對于優化臨床管理，指導感染控制和公共衛生干預措施至關重要。核酸檢測的方法有很多，每種技術都有不同的優點和局限性[49-57]。理想的診斷既準確又方便，并能迅速提供檢測結果，允許在無技術人員或復雜設備的情況下對多種臨床標本進行檢測。高致病性病毒可能在醫療資源落后地區出現，但也可能在全球范圍內傳播(如埃博拉病毒和中東呼吸綜合征冠狀病毒)，這就需要一種能夠在疾病發展早期進行快速和準確檢測的即時確診方法[52]。

以IgG/IgM作為檢測靶標的檢測試劑盒周轉時間短，不需要額外的設備或熟練的技術人員，可作為一種即時診斷方法。然而，IgG/IgM檢測試劑盒假陽性率高，不適合單獨臨床使用。因此，有人建議IgG/IgM檢測試劑盒可作為RT-PCR的補充選擇[53,54]。基于CRISPR的方法整個檢測過程僅需40 min，然而，基于RT-PCR的方法完成PCR程序大約需要1.5 h。mNGS方法大約需要20 h，其中文庫準備8 h，測序10 h，生物信息學分析2 h。因此，與臨床SARS-CoV-2常規檢測方法RT-PCR和mNGS相比，基于CRISPR的檢測方法檢測速度更快，有望開發為SARS-CoV-2及時檢測試劑盒。

與RT-PCR方法相比，基于CRISPR的檢測方法具有以下優點:(1)等溫擴增省去了使用昂貴的熱循環設備和耗時的變溫過程，具有靈敏度高及檢測速度快等優勢；(2)CRISPR的方法易于與其它簡單的方法(如側向流層析)相聯合，省去復雜的實驗室基礎設施，適合開發成現場檢測的方法。RT-PCR檢測方法與基于CRISPR的檢測方法靈敏度、特異性等對比見表1。因此，基于CRISPR的檢測方法有望開發為臨床檢測試劑盒用于SARS-CoV-2的快速、靈敏和可視化檢測，用于為醫療欠發達及偏遠地區篩查和監測COVID-19。

表1 RT-PCR檢測方法與基于CRISPR檢測方法的靈敏度、特異性等對比表

3 基于CRISPR技術的SARS-CoV-2核酸檢測臨床應用

2020年5月，首款基于CRISPR技術的新冠病毒檢測產品(The SherlockTMCRISPR SARS-CoV-2 kit)獲美國FDA緊急使用授權[55]，該檢測基于張鋒團隊開發的SHERLOCK技術，在鼻、口、喉拭子或肺部液體中檢測SARS-CoV-2的ORF1ab和N基因片段，最低檢測限可達6.75 Mcopies·L-1，檢測的特異性和敏感性均為100%，且1 h之內出檢測結果。另外，在國內由杭州眾測生物科技有限公司聯合CRISPR技術及重組酶介導鏈替換核酸擴增技術研發的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒(CRISPR免疫層析法)已獲批。

4 結論與展望

SARS-CoV-2在全球的迅速傳播給全世界人民帶來了嚴重的影響。目前臨床上SARS-CoV-2檢測可以通過RT-PCR方法進行，但基于RT-PCR的SARS-CoV-2檢測方法面臨如下問題：(1)試劑和設備的缺乏使得在SARS-CoV-2爆發及醫療條件欠發達地區不能及時發現與確診。(2)檢測靈敏度低，對于COVID-19恢復期患者及病毒載量比較低的患者容易出現假陰性結果。基于CRISPR的方法，如STOP，SHERLOCK和DETECTR，可以利用多種類型的標本(唾液、鼻咽拭子、呼吸道拭子、口咽拭子和支氣管肺泡灌洗液)提供高靈敏度和特異性的SARS-CoV-2檢測方法。此外，基于CRISPR的免疫層析法檢測SARS-CoV-2具有快速、低成本、便攜及可視化等優點，對于疫情爆發地區、醫療條件差及設備落后的偏遠地區疫情的防控至關重要。