核受體HNF4α通過調(diào)控雄激素受體表達(dá)促進(jìn)去勢抵抗性前列腺癌進(jìn)展

南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳龍華醫(yī)院泌尿外科，廣東 深圳 518109

目前，前列腺癌仍是威脅男性健康的重要因素，尤其是去勢抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC），患者預(yù)后極差，臨床尚無有效的治療手段［1］。隨著CRPC進(jìn)展機(jī)制研究的不斷深入，包括雄激素受體（androgen receptor，AR）在內(nèi)的核受體這一類重要的轉(zhuǎn)錄因子的作用受到越來越多的關(guān)注［2］。

肝細(xì)胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4α）屬于沒有配體或目前尚未發(fā)現(xiàn)配體的孤兒核受體亞家族成員，蛋白結(jié)構(gòu)含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain，DBD）和配體結(jié)構(gòu)域（ligand binding domain，LBD），能夠直接進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而調(diào)控機(jī)體的各項生理活動。HNF4α通常以二聚體形式與其順式作用元件相結(jié)合，處于轉(zhuǎn)錄因子“調(diào)控網(wǎng)絡(luò)”上游，廣泛參與人體代謝過程的調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控等過程［3］，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

有研究［4-5］發(fā)現(xiàn)，HNF4α在肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌和鼻咽癌等腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，表現(xiàn)為癌基因特征。但是HNF4α在前列腺癌中的作用及調(diào)控機(jī)制尚不清楚，本研究通過基于高通量測序的生物信息學(xué)分析HNF4α在不同類型前列腺癌組織中的表達(dá)水平，并且闡明這種表達(dá)水平的改變與前列腺癌患者總生存率的相關(guān)性，初步探討其通過上調(diào)AR表達(dá)介導(dǎo)CRPC進(jìn)展的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

前列腺癌細(xì)胞系LNCaP購自美國模式培養(yǎng)物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC），用含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）在37 ℃條件下培養(yǎng)。鼠抗人HNF4α單抗購自英國Abcam公司（貨號：ab41898），兔抗人AR單抗購自英國Abcam公司（貨號：ab108341），鼠抗人β-actin單抗購自英國Santa Cruz公司（貨號：sc-47778），HNF4α基因（序列號：BC137539.1）的表達(dá)克隆購自美國亞利桑那州立大學(xué)。

1.2 方法

1.2.1 Oncomine數(shù)據(jù)分析

通過Oncomine（http://www.oncomine.org）分析基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中前列腺癌臨床樣本和正常前列腺組織中HNF4α基因的mRNA表達(dá)水平［6］。分析參數(shù)包括：以HNF4α（NR2A1）為基因名稱，以前列腺癌為分析對象，以癌癥與正常組織中的表達(dá)水平作為分析類型。用于查詢微陣列數(shù)據(jù)閾值：包括癌組織和正常組織之間的表達(dá)差異倍數(shù)＞2，P＜0.05。

1.2.2 cBioPortal分析

通過cBioPortal（https://www.cbioportal.org/）綜合15個獨(dú)立的前列腺癌研究的基因組數(shù)據(jù)、臨床資料和患者數(shù)據(jù)等［6］。分析HNF4α在不同類型前列腺癌樣本中的表達(dá)變異情況，以及HNF4α表達(dá)變異的腫瘤樣本和無變異的腫瘤樣本的總生存率。

1.2.3 HNF4α過表達(dá)載體構(gòu)建

HNF4α基因通過聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增獲得全長cDNA，并將其克隆到慢病毒質(zhì)粒pLenti-puro載體上進(jìn)行過表達(dá)研究。將構(gòu)建的pLenti-HNF4α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞中進(jìn)行慢病毒包裝制備（實(shí)驗組），空的pLenti-puro載體包裝作為陰性對照（對照組）。包裝好的慢病毒經(jīng)過分離純化后用來感染LNCaP細(xì)胞。分別通過實(shí)時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）和蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測HNF4α的表達(dá)。

1.2.4 RTFQ-PCR實(shí)驗

采用TRIzol法提取細(xì)胞樣品總RNA，脫氧核糖核酸酶Ⅰ（deoxyribonuclease Ⅰ，DNaseⅠ）處理后，用PrimeScript RTase和Oligo（dT）［PrimeScript RT Master Mix，寶生物工程（大連）有限公司］的混合物在37 ℃下溫育15 min完成反轉(zhuǎn)錄cDNA合成，然后在85 ℃下5 s熱滅活反轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase，RTase）?；旌?5 ng cDNA，100 nmol/L引物對和RTFQ-PCR試劑混合物［（SYBR Premix Ex Taq，ROX Plus，寶生物工程（大連）有限公司）］在實(shí)時PCR系統(tǒng)（StepOne，Applied Biosystems，US）中以95 ℃ 20 s進(jìn)行PCR，隨后再以95 ℃ 15 s、60 ℃20 s、72 ℃ 30 s為1個周期進(jìn)行40次循環(huán)。

1.2.5 Western blot檢測

采用RAPI 冷裂解緩沖液（含終濃度為1 mmol/L 的苯甲基磺酰氟）提取全細(xì)胞蛋白。采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離和轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，脫脂奶粉封閉后進(jìn)行一級和二級抗體溫育，隨后用Western blot檢測系統(tǒng)（美國Amersham公司）檢測蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 螢光素酶報告基因?qū)嶒?/p>

構(gòu)建包含HNF4α蛋白潛在結(jié)合位點(diǎn)的AR啟動子區(qū)域PGL-4-AR載體，通過螢光素酶報告基因試劑盒［Renilla（貨號：ab228546，英國Abcam公司）］測定螢光素酶活性［7］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0和GraphPad Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。定量資料進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組間差異采用t檢驗法分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HNF4α在前列腺癌組織中表達(dá)顯著升高

Oncomine數(shù)據(jù)分析4個獨(dú)立的基于高通量的測序研究［8-11］，提取HNF4α基因mRNA表達(dá)的數(shù)據(jù)，分析發(fā)現(xiàn)相較于正常前列腺組織，HNF4α在前列腺癌臨床樣本中表達(dá)顯著升高（P＜0.05，圖1）。

圖1 HNF4α在前列腺癌組織中的表達(dá)水平分析Fig.1 The expression of HNF4α in prostate cancer tissues

2.2 HNF4α在不同前列腺癌類型中的表達(dá)及其對總生存率的影響

通過cBioPortal分析了15個獨(dú)立研究中的4 153份樣本，結(jié)果顯示，在惡性程度更高的CRPC和神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌（neuroendocrine prostate cancer，NEPC）中，HNF4α表達(dá)改變比例顯著升高（圖2A）。另外，HNF4α表達(dá)改變組的患者總生存率顯著低于未改變組（圖2B，P=0.000 6）。

2.3 HNF4α的外源表達(dá)促進(jìn)了前列腺癌LNCaP細(xì)胞中AR的表達(dá)

通過構(gòu)建HNF4α外源表達(dá)載體，特異性地上調(diào)前列腺癌LNCaP細(xì)胞中HNF4α的表達(dá)水平（圖3A、B），分別通過RTFQ-PCR和Western blot檢測AR mRNA表達(dá)和蛋白水平，結(jié)果顯示，AR mRNA和蛋白的表達(dá)呈顯著上調(diào)趨勢（圖3C、D）。

圖2 HNF4α在不同前列腺癌類型中的表達(dá)及其對總生存率的影響Fig.2 The alteration of HNF4α in subtypes of prostate cancer and its effect on OS

圖3 HNF4α的外源表達(dá)促進(jìn)了AR的表達(dá)水平Fig.3 Ectopic expression of HNF4α promoted the AR exresspin in LNCaP cells

2.4 HNF4α可能通過直接靶向AR啟動子區(qū)域從而介導(dǎo)AR表達(dá)上調(diào)

通過基因序列分析發(fā)現(xiàn)，在AR基因的啟動子區(qū)域存在潛在的HNF4α蛋白結(jié)合位點(diǎn)（5’-GGACTTTG-3’，圖4A）。通過構(gòu)建PGL-4螢光素酶報告載體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著轉(zhuǎn)染HNF4α表達(dá)質(zhì)粒的增加，螢光素酶活性顯著升高（圖4B），表明HNF4α很可能通過直接靶向AR啟動子區(qū)域從而介導(dǎo)AR基因表達(dá)上調(diào)。

圖4 HNF4α啟動子區(qū)域的螢光素酶報告基因分析Fig.4 Luciferase reporter assay of HNF4α promoter

3 討 論

目前研究認(rèn)為CRPC進(jìn)展機(jī)制可概括為AR依賴型和AR非依賴型兩種［12-13］。在所有的CRPC進(jìn)展機(jī)制中AR信號通路的異常活化仍然在前列腺癌進(jìn)展中起主導(dǎo)作用，阻斷雄激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍是一個重要的治療手段［14］，但是AR的異?；罨瘷C(jī)制尚未完全清楚。

本研究結(jié)合生物信息學(xué)分析闡明了HNF4α在前列腺癌臨床樣本中呈上調(diào)表達(dá)的特征，并且在惡性程度更高的CRPC及NEPC樣本中，HNF4α表達(dá)上調(diào)的比例顯著升高。因此，HNF4α可能在前列腺癌細(xì)胞中發(fā)揮著癌基因的功能，并與前列腺癌的惡性進(jìn)展密切相關(guān)，與在肝癌、胃癌及結(jié)直腸癌中的發(fā)現(xiàn)相似。有研究［15］表明，HNF4α通過直接靶向CYP2B6和GSTK1基因的啟動子，調(diào)控活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成相關(guān)基因的表達(dá)，從而防止或減少結(jié)直腸癌細(xì)胞中自發(fā)性和5-FU化療誘導(dǎo)的ROS生成。在鼻咽癌中HNF4α表達(dá)顯著上調(diào)，通過靶向基質(zhì)金屬蛋白酶-14（matrix metalloproteinase-14，MMP-14）基因調(diào)控從而可以在體內(nèi)外促進(jìn)NB細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成［16］。本研究在前列腺癌這一激素依賴型腫瘤LNCaP細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)HNF4α表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)AR基因的表達(dá)，并且很可能是通過直接靶向AR基因啟動子區(qū)中的HNF4α結(jié)合位點(diǎn)（5’-GGACTTTG-3’）而發(fā)揮作用。

鑒于AR及AR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展及臨床治療過程中的重要作用，核受體HNF4α在AR異常表達(dá)及其信號激活過程中的作用機(jī)制值得深入研究，HNF4α有望成為前列腺癌新的治療靶點(diǎn)。