FGFR抑制劑BGJ398對白血病細胞生物學行為及耐藥的影響

濱州醫學院附屬醫院兒科，山東 濱州 256603

成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）是一類由垂體和下丘腦分泌的多肽，目前已發現23種家族成員，FGF家族成員有相同的核心結構，能夠調節細胞增殖、遷移和分化，在腫瘤性疾病的發生和轉移等過程中發揮重要作用［1］。FGF必須與FGF受體（FGF receptor，FGFR）結合才能發揮其生物學活性，進而啟動細胞內信號轉導，目前已經確認的FGFR有4種，他們都是一類穿膜的酪氨酸激酶受體，分別由4個獨立基因編碼，這4種受體功能相近，均參與細胞的增殖、遷移和分化等過程［2-5］。有研究［6］表明，FGF與白血病的發病有關，FGFR抑制劑能有效地阻斷FGF與FGFR結合，但對白血病細胞耐藥的影響未見報道。本研究擬探討FGFR抑制劑BGJ398對耐藥細胞株K562/ADM增殖、凋亡及耐藥的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

FGFR 抑制劑BGJ 398 購自美國MedChemExpress公司；人慢性髓細胞性白血病耐藥細胞K562/ADM由濱州醫學院附屬醫院臨床實驗室保存；細胞計數試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購自大連美侖生物技術有限公司；Annexin Ⅴ-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（prodium iodide，PI）細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司；核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司；RPMI-1640培養基購自美國Hyclone公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自美國Sigma公司；MDR1（即P-gp，兔抗人多克隆抗體141×103）購自北京博奧森生物技術有限公司；兔抗人α-tubulin單克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體由北京博奧森生物技術有限公司進口分裝；瑞士-吉姆薩復合染液購自珠海貝索生物技術有限公司；注射用阿糖胞苷（cytarabine，Ara-c）購自意大利Pharmacia公司，注射用鹽酸柔紅霉素（daunorubicin，DNR）購自意大利Pfizer公司。

1.2 細胞及細胞培養

K562/ADM細胞是人慢性髓細胞性白血病K562細胞的阿霉素耐藥株，將K562/ADM細胞置于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、青霉素和鏈霉素各100 U/L的RPMI-1640培養基中，在37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中懸浮培養，每2～3 d傳代1次。取生長狀態良好、處于對數生長期的細胞進行實驗。BGJ398粉劑用DMSO溶解為10 mmol/L母液備用。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖抑制率

取100 L細胞懸液（2.5×103個細胞）接種到96孔板中，BGJ398的作用濃度分別為0.0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0 mol/L，每個濃度設3個復孔，在37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中懸浮培養48 h后，每孔加入10 μL CCK-8增強型溶液，輕輕敲擊培養板以混勻。培養箱內溫育2 h，在450 nm波長下測定吸光度（D）值并計算細胞增殖抑制率。抑制率=［（Ac-As）／（Ac-Ab）］×100%。As：實驗孔（含有細胞的培養基、CCK-8、待測藥物）的D值；Ac：對照孔（含有細胞的培養基、CCK-8、沒有待測藥物）的D值；Ab：空白孔（不含細胞和待測藥物的培養基、CCK-8）的D值。

1.4 細胞transwell遷移實驗

將K562/ADM細胞分為3組：實驗組、陰性對照組、空白對照組。實驗組：加入FGFR抑制劑（10 μmol/L）；陰性對照組：加入與實驗組相同濃度的DMSO（1%）；空白對照組：加入相同體積的細胞培養基。收集細胞，將3組K562細胞用無血清培養基重懸，取100 μL細胞懸液（3×104個/孔）種入上室，下室加完全培養基，每組設4個復孔，培養4 h后，除去transwell上室中的細胞，然后將下室中的細胞采用瑞士-吉姆薩復合染液進行染色，400倍光學顯微鏡下每組隨機選取5個視野，計數穿膜的細胞個數，并計算每組的平均值。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

取3組K562/ADM細胞，常規培養48 h后以2 000 r/min離心5 min收集細胞，用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌細胞2次，收集5×105個細胞，加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC混勻后，加入5 μL PI，混勻，室溫、避光條件下，反應5～15 min，采用流式細胞術檢測細胞凋亡情況。

1.6 CCK-8 法檢測化療藥物對各組細胞的半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）

取對數生長期K562/ADM細胞，分為空白對照組、陰性對照組、實驗組，每孔100 μL（含1×104個細胞）接種于96孔培養板上，每組細胞分別加入不同濃度的Ara-c、DNR，Ara-c終質量濃度為0、1、5、25、125、625 μg/mL，DNR終質量濃度為0、20、40、80、160、320 ng/mL，每個濃度設3個復孔，在37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中懸浮培養48 h后，每孔加入10 μL CCK-8增強型溶液，輕輕敲擊培養板以混勻。培養箱內溫育2 h，在450 nm波長下測定D值并計算細胞增殖抑制率。調零后取各組平行孔平均值，計算細胞增殖抑制率。抑制率=（1-實驗組A值/細胞對照組A值）×100%。

1.7 蛋白質印跡法（Western blot）檢測MDR1（P-gp）蛋白的表達

取3組K562/ADM細胞，常規培養48 h后以2 000 r/min離心5 min收集細胞，用PBS洗滌細胞2次，依據蛋白提取試劑盒說明書，依次加入Buffer A、B、C，充分裂解細胞膜和細胞核，取少量蛋白用BCA法測蛋白濃度，其余加5×十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）上樣緩沖液煮沸5 min，-80 ℃保存備用。取等量標本進行SDSPAGE，后將蛋白轉移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的洗膜緩沖液（tris buffered saline Tween，TBST）封閉2 h，充分漂洗后加兔抗人多克隆抗體MDR1（稀釋度為1∶400），4 ℃溫育12 h，充分洗滌后加山羊抗兔二抗（稀釋度為1∶2 000），室溫溫育1.5 h，漂洗后采用化學發光法顯色。以α-tubulin作為內參重復進行以上步驟。采用Gel-Pro Analyzer軟件分析結果，以MDR1/α-tubulin的比值作為目的蛋白的相對表達水平。

2 結果

2.1 BGJ398對K562/ADM細胞增殖的影響

統計顯示，BGJ398的作用濃度分別為0.5、1.0、2.0 μmol/L時細胞的增殖抑制率與對照組差異無統計學意義（P＞0.05），BGJ398的作用濃度分別為5.0、10.0、15.0 μmol/L時，細胞的增殖抑制率低于對照組，差異有統計學意義（F=144.1，P＜0.001）。K562/ADM細胞增殖抑制率隨藥物濃度的增加而逐漸提高（圖1），最小顯著差別（least significant difference，LSD）組間兩兩比較發現，0.5和1.0 μmol/L組間差異無統計學意義（P=0.226），其余組間兩兩比較差異均有統計學意義（F=1 904.8，P＜0.05）。以上結果提示BGJ398濃度高于5.0 μmol/L時能有效地抑制白血病細胞的增殖，后續實驗采用10.0 μmol/L的作用濃度。

圖1 不同藥物濃度組K562/ADM細胞增殖抑制率的比較Fig.1 Comparison of the inhibitory rate of K562/ADM cells in different concentration groups

2.2 BGJ398對K562/ADM細胞遷移的影響

培養4 h 后BGJ 398 組遷移的K562/ADM細胞數（11.00±3.00）較陰性對照組（57.67±14.57）和空白對照組（43.00±4.00）明顯減少，差異有統計學意義（F=21.60，P=0.002），提示BGJ398可以有效抑制K562/ADM細胞遷移。

2.3 BGJ398對K562/ADM細胞凋亡的影響

實驗組細胞凋亡率（81.49%±5.38%）顯著增加，與空白對照組（10.09%±1.36%）和陰性對照組（7.64%±1.32%）相比，差異有統計學意義（F=487.28，P＜0.001），FGFR抑制劑顯著抑制耐藥白血病細胞增殖，且促進其凋亡（圖2）。

圖2 各組細胞凋亡率的比較Fig.2 Comparison of cell apoptotic rate in each group

2.4 FGFR抑制劑對化療藥物敏感性的影響

實驗組細胞對Ara-c、DNR的IC50明顯低于空白對照和陰性對照組細胞（Ara-c：F=55.39，P=0.000；DNR：F=110.94，P=0.000），空白對照組和陰性對照組相比差異無統計學意義（Ara-c：P=0.22；DNR：P=0.16），提示FGFR抑制劑能顯著增強白血病細胞對Ara-c、DNR的藥物敏感性，起到降低化療藥物濃度、增強療效的作用（表1）。

表1 各組細胞的IC50Tab.1 IC50of each group

2.5 FGFR抑制劑對MDR1（P-gp）蛋白表達水平的影響

Western blot實驗結果顯示，實驗組MDR1蛋白表達水平為0.056 0±0.008 8，空白對照組和陰性對照組MDR1蛋白表達水平分別為0.132 8±0.012 2和0.116 6±0.018 8，實驗組與空白對照組和陰性對照組相比差異有統計學意義（F=16.97，P＜0.05），空白對照組和陰性對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05，圖3）。

圖3 Western blot檢測各組細胞MDR1（P-gp）蛋白表達水平Fig.3 The expression of MDR1 (P-gp) protein was detected by Western blot

3 討 論

白血病是兒童最常見的惡性腫瘤，由于造血細胞惡性增殖可破壞骨髓正常功能、導致骨髓衰竭。慢性髓細胞性白血病僅占兒童和青少年白血病的2%～3%。兒童和青少年慢性粒細胞白血病往往表現出更具侵襲性的特征［7］。因此，兒童慢性髓細胞性白血病需要更加有效的治療措施。

FGFR信號通路參與細胞生長、分化和遷移，因此FGFR擴增、突變或基因融合導致的信號通路異常激活與多種癌癥的發病機制有關，例如尿路上皮癌中的FGFR3突變［8］。白血病微環境的保護作用可導致白血病細胞持續存活、耐藥和復發。Javidi-Sharifi等［9］研究發現，骨髓基質細胞的FGF2在外泌體中分泌，這些外泌體隨后被白血病細胞內吞，并保護白血病細胞免受酪氨酸激酶抑制劑的傷害，FGF2及其受體FGFR1在基質細胞亞群和急性髓細胞性白血病基質中的表達均增加，FGF2-FGFR1信號通路的增加與外泌體分泌的增加有關，FGFR抑制劑阻斷基質自分泌生長，顯著降低含FGF2的外泌體的分泌，導致白血病細胞的基質保護作用減弱；因此，抑制FGFR的作用可以調節骨髓基質功能，減少外泌體分泌，降低耐藥性，改善療效。

尼達尼布是一種三重血管激酶抑制劑，可抑制血管內皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）、血小板衍生生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）。有研究［10］將尼達尼布與小劑量Ara-c聯合應用于治療老年急性髓細胞性白血病患者，結果顯示，該藥物的安全性和治療效果較好，為難治性白血病患者帶來了新的希望，但尚無應用于兒童白血病的報道。尼達尼布是多靶點抑制劑，其使用受到不良反應的限制，易引起心血管和肝臟毒性［11］。

BGJ398是成纖維細胞生長因子受體抑制劑，能有效地抑制FGFR1、FGFR2和FGFR3，但對FGFR4的抑制作用較弱。Ma等［12］研究發現，BGJ398能有效地抑制人脂肪干細胞的增殖。本研究發現，BGJ398能顯著抑制耐藥細胞株K562/ADM的增殖，BGJ398濃度大于5.0 μmol/L時對腫瘤細胞抑制作用比較明顯，濃度繼續增大，濃度為15.0 μmol/L時抑制率達到97.41%，濃度≥15.0 μmol/L時不良反應可能會大大增加，因此藥物濃度在10.0 μmol/L左右比較合適，既保證療效又可減少藥物引起的不良反應。BGJ398作用濃度為10.0 μmol/L時能有效地抑制耐藥細胞株的遷移，對白血病細胞的肝、脾、淋巴結、骨骼浸潤起到很好的抑制作用。BGJ398具有顯著促進耐藥白血病細胞株凋亡的作用，BGJ398與常規化療藥物Ara-c、DNR聯合應用可起到增強療效、降低不良反應的效果。進一步通過機制研究發現，FGFR抑制劑能顯著降低耐藥蛋白MDR1的表達水平，提示MDR1可能是BGJ398逆轉K562/ADM耐藥的作用靶點之一。

BGJ398的作用還存在不足之處。BGJ398自身在治療腫瘤性疾病過程中也會產生耐藥性，如BGJ398治療膽管癌的Ⅱ期臨床試驗［13］表明，隨著用藥時間延長，機體也會對BGJ398產生耐藥性，需要應用mTOR抑制劑克服耐藥。目前有研究［14］發現，TAS-120是一種新型的不可逆FGFR抑制劑，對BGJ398耐藥膽管癌有更好的治療效果。

綜上，FGFR抑制劑能顯著抑制白血病細胞增殖和遷移，促進其凋亡，增強化療藥物的敏感性并降低耐藥蛋白的表達水平，可能成為逆轉白血病耐藥的新靶點。FGFR抑制劑已成為目前抗腫瘤治療的研究熱點之一，新型FGFR抑制劑不斷涌現，為人類克服腫瘤性疾病帶來了新希望。