免疫蛋白酶體抑制劑PR957對DOCA-高鹽高血壓小鼠腎臟纖維化的保護作用

鄢雯 李囡 王世全 曾令娥 劉立新

(首都醫科大學燕京醫學院臨床醫學學系,北京 101300)

腎臟纖維化是高血壓引起靶器官損傷的重要病理變化，主要由于大量膠原蛋白沉積，最終取代正常腎臟結構，導致腎小球硬化及腎小管間質的纖維化，造成腎臟功能進行性喪失[1-2]。泛素蛋白酶體系統(ubiquitin-proteasome system，UPS)是真核細胞內調節蛋白質降解的主要途徑之一。β5i是UPS蛋白酶解中心的核心催化亞基[3]，可產生糜蛋白酶樣活性。我們發現免疫蛋白酶體亞基β5i參與鹽敏感型高血壓的小鼠心肌重構的病理過程[4]，但其在腎臟纖維化的作用尚不甚清楚。本研究通過建立醋酸脫氧皮質酮(desoxycorticosterone acetate,DOCA)-鹽敏感高血壓模型，以特異性蛋白酶體抑制劑PR957進行治療，通過對小鼠血壓及腎組織纖維化指標表達變化的研究，觀察和分析β5i對DOCA-鹽敏感型高血壓小鼠腎臟纖維化的影響。報告如下。

1 材料和方法

1.1實驗動物 C57BL/6J小鼠，雄性，8～10周齡，體重(23±2)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號：SCXK(京)2012～0001。遵照首都醫科大學生物醫學倫理委員會實驗動物相關倫理標準，實驗前采用普通飼料適應性喂養小鼠1周，實驗期間小鼠自由飲水和進食。

1.2實驗試劑和儀器 (1)主要試劑為：DOCA(Sigma)；PR-957(Selleck Chemicals)；總RNA提取及及TaKaRa逆轉錄試劑盒(Promega)；Trizol(Invitrogen)；SYBR Green(TaKaRa)；Masson三色染色試劑盒(Solarbio)。(2)主要儀器為：BP 98A鼠尾套管血壓計(Softron)；real-time聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)儀(Bio-Rad)；TP1020半封閉全自動組織脫水機(Leica)。

1.3方法

1.3.1動物模型復制及分組 根據實驗設計，將C57BL/6J雄性小鼠隨機分為四組(每組n=8)：假手術組，PR-957組，DOCA-salt組和DOCA-salt+PR-957組。模型制備步驟[5]：(1)三溴乙醇(12 ml/kg)腹腔注射麻醉小鼠，在位于脊柱左側肋緣下1 cm處作一長約1 cm的切口，暴露腎臟，結扎腎門處血管，剝離腎被膜，切除左腎后縫合肌肉和皮膚；(2)植入DOCA藥片前一天，PR-957組和DOCA-salt+PR-957組皮下開始注射PR-957(12 mg/kg，每周4次)，其余兩組皮下注射DMSO與生理鹽水的混合液；(3)腎臟切除2天后，DOCA-salt組和DOCA-salt+PR-957組在右肩背部皮下植入DOCA藥片并飲用含0.9% NaCl和0.2% KCl的高鹽水3周，其余兩組正常飲水；(4)術后，每隔2天在固定時間進行鼠尾套管血壓測定。

1.3.2血壓測量 采用BP-98A鼠尾套管血壓儀進行血壓測量。實驗前1周在上午8～11點固定時間監測小鼠基礎血壓2次，以減少實驗小鼠因緊張等不適造成的實驗誤差。在術后每隔2 d在相同時間進行血壓測定，每只實驗小鼠每次重復測量8～10遍血壓，記錄收縮壓值并進行數據統計分析。

1.3.3腎臟取材 小鼠麻醉后，剪取小鼠腎臟，用濾紙吸干腎臟表面的水分稱重并記錄，去掉包膜及周圍脂肪組織,稱重記錄腎重/體重指數 (kidney weight/body weight,KW/BW) ,提RNA的腎臟組織用液氮冷凍后保存于-80℃冰箱。用4 %多聚甲醛固定腎臟，然后用石蠟包埋、切片，脫蠟后進行Masson染色和免疫組化分析。

1.3.4腎組織病理檢查 將多聚甲醛固定的腎組織制成3 μm厚的石蠟切片，行HE及Masson染色，用顯微鏡觀察并采集圖像，Masson染色結果運用Image-Pro Plus 6.0軟件掃描圖像并分析膠原沉積情況。

1.3.5腎臟組織RNA的提取及RT-PCR 腎臟組織RNA的提取及RT-PCR實驗方法見參考文獻[6]。引物的設計及合成由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。見表1。

表1 引物序列

2 結 果

2.1各組小鼠血壓情況 為了探討PR-957對小鼠血壓的影響，我們在造模前兩天至造模后3周每隔2天進行血壓測定。與Sham組相比，埋入DOCA藥片和高鹽飲食 4 d后，DOCA-salt組小鼠血壓開始明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，而DOCA-salt+PR-957組則明顯降低DOCA-salt誘導的血壓升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：DOCA-salt處理后，檢測小鼠的動脈收縮壓(Systolic Arterial Pressure)變化情況(n=8～10次)。*P<0.05與Sham組比較；#P<0.05與DOCA-salt組比較。圖1 各組小鼠血壓的變化

2.2各組小鼠腎臟體積和腎質量/體質量 與Sham組比較，DOCA-salt處理后腎臟體積和KW/BW比率增高明顯，差異有統計學意義(P<0.05)，腹部皮下注射PR-957可明顯抑制DOCA-salt誘導的腎臟體積和KW/BW比率增大，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：(A)DOCA-salt處理21 d后，腎臟大體照片；(B)DOCA-salt處理21 d后，各組小鼠的KW/BW比值(n=5-6)；*P<0.05與Sham組比較；#P<0.05與DOCA-salt組比較。圖2 各組小鼠腎體積和腎質量/體質量比值

2.3腎組織病理改變 HE及Masson染色可見sham組小鼠腎小管結構清晰完整，腎小管上皮細胞排列整齊，基底膜完整,間質未見炎性細胞浸潤；DOCA-salt組小鼠腎小管腔擴張明顯，腎小管基底膜不規則增厚,腎小管上皮細胞出現空泡狀改變,細胞萎縮和脫落，小管間質細胞增多伴有炎性細胞的浸潤，間質區增寬，腎小管間質膠原沉積增多，差異有統計學意義(P<0.05) ；DOCA-salt+PR957組小鼠腎臟病變有不同程度的改善,腎小管間質膠原沉積明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05) ,炎性細胞浸潤減輕,空泡狀改變不明顯。證實PR-957可以明顯降低DOCA-salt引起的腎臟炎癥反應和纖維化。見圖3。

注：(A)DOCA-salt處理并腹部皮下注射PR-957后，腎臟組織進行Masson染色(×200倍)(B)DOCA-salt處理并腹部皮下注射PR-957后，腎臟組織進行HE染色(×200倍)。圖3 各組小鼠腎組織病理學變化

2.4qPCR結果 與Sham組相比，DOCA-salt組小鼠腎組織纖維化因子Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和炎癥因子ⅠL-1β、ⅠL-6、TNF-α的表達顯著上調，差異有統計學意義(P<0.05)；PR957干預后，膠原Ⅰ、膠原Ⅲ、ⅠL-1β、ⅠL-6和TNF-α的表達較DOCA-salt組顯著減少，差異有統計學意義(P<0.05) 。見圖4。

注：(A)DOCA-salt處理并腹部皮下注射PR-957后， qPCR檢測腎臟Collegen Ⅰ和CollegenⅢ水平。(B)qPCR檢測腎臟炎癥因子ⅠL-1β、ⅠL-6、TNF-α和MCP-1的mRNA水平(n=6)。*P<0.05與Sham組比較；**P<0.01與Sham組比較；#P<0.05與DOCA-salt組比較。圖4 蛋白酶體抑制劑PR-957減輕DOCA-salt引起的炎癥反應

3 討 論

高血壓病是目前臨床上最常見的慢性病，鹽敏感性高血壓是原發性高血壓的一種常見類型。DOCA為醋酸脫氧皮質酮，有醛固酮樣的作用，DOCA鹽敏感高血壓模型類似于人類繼發性高血壓病的原發性醛固酮增多癥，與水鈉潴留、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)激活、血管活性肽物質增多等多種機制有關[7]。我國成人中患有原發性高血壓病的患者約10%～15%會發展到慢性腎衰竭。在高血壓患者中,體內血管內皮的炎癥反應可以導致腫瘤壞死因子、血小板源生長因子的大量生成,誘導其變成單核細胞、纖維細胞,形成ⅠL-6,而ⅠL-6又能夠增加纖維細胞、平滑肌細胞的表達,最終引發周圍血管阻力的升高,導致疾病的產生[8]。長期的高血壓會使腎小球處于高濾過和高灌注狀態，進而導致系膜細胞增生硬化，局部腎小球及腎小管缺血、功能受損，導致腎小管間質炎性細胞浸潤及腎小球纖維化等病理學改變[9]。

泛素蛋白酶體系統(ubiquitin-proteasome system，UPS)是真核細胞清除蛋白質主要通路，參與調節細胞周期、基因轉錄、抗原呈遞、細胞增殖與分化以及信號轉導等多種生理過程。免疫疫蛋白酶體中β1i、β2i和β5i是催化亞基，其中β5i亞基由275個氨基酸組成，具有糜蛋白酶樣活性，β5i作為免疫蛋白酶體的核心亞基，具有糜蛋白酶樣活性，可以調節免疫炎癥反應、氧化應激及提呈內源性抗原或病毒介導的MHC-Ⅰ限制性抗原[10]。最近研究發現了一種β5i亞基的特異性抑制劑，其活性成分為PR-957(ONX 0914)[11]。研究表明PR-957可抑制小鼠自身免疫和炎癥相關性疾病[12]。我們既往研究證明在DOCA鹽敏感型高血壓小鼠心肌中β5i蛋白水平明顯上調，而β5i抑制劑PR-957處理后可明顯改善DOCA鹽誘導的腎臟功能增高及心肌肥厚[4]。但是，PR-957在DOCA鹽敏感高血壓性腎臟纖維化的作用尚不清楚。

本實驗結果表明免疫蛋白酶體抑制劑PR-957顯著降低DOCA/鹽引起腎小管-間質纖維化的發展和炎癥因子( ⅠL-1β、ⅠL-6 和TNF-α) 的表達，提示PR957對DOCA-高鹽高血壓小鼠的腎臟損傷可以起保護作用。免疫蛋白酶體β5i 亞基可作為治療高血壓性腎臟損傷的一個潛在新靶點。但其深入的機制仍需要進一步研究。