高效液相色譜法測定清熱解毒顆粒中鹽酸小檗堿的含量

萬勇，楊毅生，付志文，周志強，洪挺

1.江西省藥品檢查員中心，江西 南昌 330029；2.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029；3.江西康恩貝中藥股份有限公司，江西 上饒 334400

清熱解毒顆粒是由金銀花、連翹、黃連、知母、石膏、水牛角、玄參、地黃、大青葉等九味中藥材組成，具有清熱解毒，養(yǎng)陰生津，瀉火等功效。臨床最早用于輕、中型乙型腦炎，后來發(fā)現(xiàn)其具有良好的治療風(fēng)熱型感冒、流行性腮腺炎的作用［1］。方中金銀花、連翹疏散風(fēng)熱，清熱解毒，為君藥；石膏、知母、黃連清熱瀉火解毒，為臣藥；水牛角、大青葉、地黃、玄參清熱涼血，合為佐藥；全方共奏清熱解毒的作用。

《中國藥典》2015 年版一部中收載的清熱解毒片和清熱解毒口服液［2］，以及其他兩個清熱解毒顆粒醫(yī)院制劑［3-5］處方藥味組成均同本課題清熱解毒顆粒不同，屬于同名異方。本研究的清熱解毒顆粒現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)《中藥成方制劑》第十三冊（WS3-B-2618-97），標(biāo)準(zhǔn)正文只收載了［性狀］、［鑒別］（1）理化鑒別皂苷類化學(xué)成分、［鑒別］（2）理化鑒別處方中石膏、［鑒別］（3）顯微鑒別處方中黃連的鹽酸小檗堿、［檢查］項。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)簡單，質(zhì)量控制研究文獻相對較少［6-8］，且通過顯微鑒別黃連中鹽酸小檗堿方法落后，干擾較大、難于觀察，故本研究采用HPLC 法測定其鹽酸小檗堿的含量，以期為清熱解毒顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制提供參考。

1 儀器與試劑

安捷倫1260 高效液相色譜儀（含OpenLab CDS色譜工作站，四元泵、自動進樣器和DAD 檢測器）、Sartorius BSA124S-CW 型電子天平（德國賽托利斯公司），TE212-L 型十萬分之一天平（德國賽托利斯公司）。

鹽酸小檗堿對照品（批號：120913-201310，含量以86.8% 計），購自于中國食品藥品檢定研究院。乙腈為購于Sigma 公司（色譜純），其他均為分析純。清熱解毒顆粒共15 批次，分別為A 公司3 批171201、171202、171203，B 公司1 批，批號為171201，C 公司3 批，批號分別為17430502、17430503、17430504，D 公司5 批，批號分別為161002、170501、170502、171001（無蔗糖）、170501（無蔗糖）；E 公司3 批均為無蔗糖型，批號分別為20170901、20170902、20170302。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的配制

精密稱定鹽酸小檗堿對照品適量，加50%甲醇-鹽酸（100∶1）溶解成每毫升含鹽酸小檗堿0.04 mg的對照品溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備

取裝量差異下的清熱解毒顆粒適量，研細(xì)，精密稱取2 g，然后加入50 mL 燒瓶中，再精密加入50%甲醇-鹽酸（100∶1）25 mL，稱定重量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷后再稱定重量，加溶劑補足損失的重量，搖勻，離心，取上清液，作為供試品溶液。

2.3 陰性對照溶液的制備

取處方中缺黃連的其它藥材，照清熱解毒顆粒生產(chǎn)工藝制備陰性樣品，再按“2.2”項方法制成陰性對照溶液。

2.4 色譜條件

色譜柱：SunFire C18 柱（4.6×250 mm，5 μm），以乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（22∶78）為流動相；流速為 1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為346 nm，進樣量：5 μL。依照上述色譜條件進行測定，結(jié)果色譜圖中顯示其他化學(xué)成分對鹽酸小檗堿色譜峰無干擾［9-12］，分離度良好。理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿色譜峰計應(yīng)不低于3 000。對照品及供試品色譜圖見圖1。

圖1 清熱解毒顆粒對照品（A）、供試品（B）和陰性（C）色譜圖

2.5 線性關(guān)系的考察

精密稱取鹽酸小檗堿對照品11.40 mg(含量為86.8%)，置100 mL量瓶中，加50%甲醇-鹽酸（100∶1）溶液溶解至刻度，作為對照品母液，精密量取上述母液1 mL 至50 mL 量瓶中，加50%甲醇-鹽酸（100∶1）溶液至刻度，作為對照品稀釋液①；精密量取上述母液2 mL 至50 mL 量瓶中，加50%甲醇-鹽酸（100∶1）溶液至刻度，作為對照品稀釋液②。精密吸取上述對照品稀釋液①2 μL、5 μL、10 μL，對照品稀釋液②10 μL，對照品母液2 μL、5 μL，進入HPLC 色譜儀，測定峰面積，以峰面積A 為縱坐標(biāo)，進樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，鹽酸小檗堿回歸方程為Y=4 003.322 0X+2.035 6，R2=0.999 9，鹽酸小檗堿在0.003 958～0.494 8 μg 之間具有較好線性。

2.6 精密度試驗

精密吸取對照品溶液，注入HPLC 色譜儀，連續(xù)測定6 次，結(jié)果對照品峰面積RSD 為0.5%，表明儀器具有較好的精密度。

2.7 重現(xiàn)性試驗

取本品（A 公司，批號：171202）6 份，依法制備供試品溶液，進行測定，結(jié)果供試品溶液中鹽酸小檗堿含量平均值為0.035 mg/g，RSD 為1.3%，實驗表明該方法具有較好的重現(xiàn)性。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取本品（A 公司，批號：171202）樣品一份，依法制備供試品溶液，分別在1，2，3，6，9，12，24 h 注入HPLC 色譜儀，計算結(jié)果顯示鹽酸小檗堿峰面積的RSD 為1.1%（n=7），說明鹽酸小檗堿在24 h 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.9 回收率試驗

稱取已知鹽酸小檗堿含量的本品（A 公司，批號：171202，含鹽酸小檗堿0.035 mg/g）適量，碾磨成粉末，精密稱取1 g，置50 mL 三角瓶中，精密加入鹽酸小檗堿對照品溶液（鹽酸小檗堿對照品：0.001 187 mg/mL）25 mL，稱定重量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，冷卻，再稱定重量，加50%甲醇-鹽酸（100∶1)補足損失的重量，搖勻，離心，取上清液，即得。按正文中［含量測定］項下方法試驗，計算回收率，結(jié)果見表1。

2.10 耐用性試驗

取本品，分別用（1）SunFire-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；（2）Diamonsil-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；（3）ACES-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）3 種品牌的色譜柱進行實驗，測定結(jié)果RSD 為1.6%，表明該方法具有較好耐用性。

2.11 樣品測定

分別取供試品15 批次，按“2.2”項下供試品制備方法制備，每批平行處理2 份，每份進2 針，以平均峰面積計算鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果見表2。

表1 鹽酸小檗堿回收率試驗結(jié)果（n=6）

表2 鹽酸小檗堿含量測定試驗結(jié)果（n=6）

3 討論

清熱解毒顆粒成分復(fù)雜，化學(xué)成分豐富，為防止其他組分對鹽酸小檗堿色譜峰的干擾，采用DAD檢測器對對照品和樣品進行掃描，結(jié)果鹽酸小檗堿色譜峰在346 nm 處有最大吸收，且未被其他雜峰干擾。對建立的含量測定進行方法學(xué)考察：考察了不同提取方式，結(jié)果顯示加熱回流與超聲提取效率相似。考察了甲醇、50%甲醇、50%甲醇-鹽酸（100∶1）溶液為提取溶劑，結(jié)果顯示50%甲醇-鹽酸（100∶1）溶液為溶劑提取最完全。考察了超聲10、20、30、50 min，結(jié)果顯示超聲30 min已全部提取完全。研究還對流動相進行考察，摸索乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈（甲醇）-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液不同比例作為流動相，結(jié)果鹽酸小檗堿在乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（13∶87）為流動相，峰型最佳，分離度最好。

研究對不同企業(yè)15 批次清熱解毒顆粒進行鹽酸小檗堿含量進行測定，結(jié)果不同企業(yè)其含量差異較大，同企業(yè)樣品差異較小，表明同企業(yè)生產(chǎn)工藝較為穩(wěn)定，不同企業(yè)使用黃連藥材質(zhì)量差異較大。