急性髓性白血病預(yù)后相關(guān)基因的分析與驗(yàn)證

梅凱 舒鵬 張松 謝紅意

急性髓性白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一種異質(zhì)性的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，不同基因型AML患者對(duì)治療反應(yīng)和預(yù)后差異極大[1]，約有20%～30%患者存在著內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)的突變，使得具有酪氨酸激酶活性的原癌基因FMS樣酪氨酸激酶3基因（FLT3）異常激活，并影響患者預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn)使用FLT3抑制劑治療AML的療效較好[2]。因此如何找出AML患者中預(yù)后相關(guān)基因，并進(jìn)行相應(yīng)的驗(yàn)證成為研究熱點(diǎn)。目前已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)AML預(yù)后相關(guān)基因，Li等[3]通過對(duì)499例AML患者基因表達(dá)數(shù)據(jù)與臨床資料進(jìn)行單因素Cox回歸分析，得到24個(gè)與患者總體生存率顯著相關(guān)的基因。Torrebadell等[4]先對(duì)40例造血干細(xì)胞移植后AML患者基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到187個(gè)疾病復(fù)發(fā)相關(guān)基因后，使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）驗(yàn)證得到BAALC、MN1、SPARC與HOPX基因。盡管如此，在得到預(yù)后、治療反應(yīng)性相關(guān)的基因后，對(duì)于這些基因在腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展中具體機(jī)制的研究則相對(duì)較少。本研究采用Cox回歸模型得到預(yù)后相關(guān)基因，并分析這些基因表達(dá)與患者總體生存率之間的關(guān)系，同時(shí)進(jìn)行相應(yīng)的機(jī)制探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2013年4月至2017年6月寧波市北侖區(qū)人民醫(yī)院收治30例AML患者初治時(shí)的骨髓單個(gè)核細(xì)胞，患者中男21例，女9例，平均年齡（42.93±25.86）歲。所有患者經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)（MICM）分型標(biāo)準(zhǔn)確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并糖尿病、心腦血管疾病、重要臟器功能異常、感染性疾病或是不配合本實(shí)驗(yàn)流程。收集2015年5月至2017年12月寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物樣本庫10例健康志愿者的骨髓單個(gè)核細(xì)胞，健康志愿者中男6例，女4例，平均年齡（37.48±12.19）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有糖尿病、心腦血管疾病等，或是基本資料不完整者。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑及儀器 人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系A(chǔ)ML-193購自國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)，包裝病毒用293t細(xì)胞由本室保藏。IMDM培養(yǎng)基（12440079）、胎 FBS（10438026）、胰島素（12585014）、轉(zhuǎn)鐵蛋白（T13342）、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（PHC2013）均購自美國Gibico公司。HECTD3-scramble與HECTD3-shRNA慢病毒載體購自美國Sigma公司，慢病毒包裝載體 PMD2.G（12259）、psPAX2（12260）均購自美國 Addgene公司。Lipofectamine 2000（12566014）購自美國ThermoFisher公司，PEG慢病毒純化試劑（LV810A-1）購自美國SBI公司。Western blot檢測(cè)中RIPA強(qiáng)裂解液（P0013B）購自上海碧云天公司，HECTD3（ab173122）抗體購自美國 Abcam 公司，ubiquitin（3933）、NF-κB 通路p65（8242）、p-p65（3033）、IKBα（5206）、p-IKBα（2859）、內(nèi)參抗體GAPDH（5174）均購自美國Cell Signaling Technology公司。RT-PCR+qPCR實(shí)驗(yàn)中Trizol（15596026）購自美國ThermoFisher公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser（RR047A）與 SYBR 檢測(cè)試劑盒 SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RNase H Plus）（RR820A）均購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)中全部引物均由深圳華大基因股份有限公司合成。細(xì)胞增殖檢測(cè)中CCK-8試劑盒（CK04）購自日本同仁化學(xué)研究所，細(xì)胞凋亡Annexin V別藻藍(lán)蛋白（Allophycocyanin,APC）/碘化丙碇（PI）雙染試劑盒（A02001-11PG）購自天津三箭生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞周期檢測(cè)中高濃度PI購自美國Sigma公司（P4170）。凝膠遷移（EMSA）實(shí)驗(yàn)中生物標(biāo)記的 NF-κB（GS056B）、OCT-1（GS061B）探針購自上海碧云天公司，核蛋白提取試劑盒（C500009-0050）購自上海生工生物工程有限公司，化學(xué)發(fā)光法EMSA試劑盒（GS009）購自上海碧云天公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 AML-193細(xì)胞系使用IMDM+5% FBS+5 μg/ml胰島素+5 μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白+5 ng/ml粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。在得到HECTD3-scramble與 HECTD3-shRNA慢病毒后，AML-193細(xì)胞分為HECTD3-scramble與HECTD3-shRNA組，分別感染HECTD3-scramble與HECTD3-shRNA慢病毒，感染復(fù)數(shù)（病毒/細(xì)胞的比值）為10 MOI。

1.4 慢病毒包裝與純化 HECTD3功能驗(yàn)證使用shRNA敲低的方法。HECTD3-scramble（對(duì)照載體）與HECTD3-shRNA載體首先包裝為慢病毒，使用第三代慢病毒包裝體系，包裝步驟：（1）PMD2.G、psPAX2、目的載體分別取 3、9、12 μg 后，使用 lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)入 293t細(xì)胞中；（2）收集 36、48、72 h 時(shí)含有病毒的培養(yǎng)上清液，并將此上清液與PEG按照體積比4∶1混合，4℃沉淀過夜；（3）所得慢病毒沉淀使用無血清DMEM重懸即得到純化后的慢病毒，使用純化后的慢病毒感染293t細(xì)胞，并采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光陽性的細(xì)胞比例（感染效率）以判定感染滴度。

1.5 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 采用Western blot法。HECTD3-scramble與HECTD3-shRNA組細(xì)胞在感染慢病毒48 h后，使用RIPA裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min，15 min后取上清液，并加入上樣緩沖液，沸水浴15 min。隨后取20 μg蛋白樣本加入預(yù)制膠中，50 V恒壓電泳，待marker在分離膠與積層膠界限分開時(shí)，120 V恒壓直至溴酚藍(lán)跑至分離膠底部，使用濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜后，5%BSA封閉2 h，標(biāo)記HECTD3、ubiquitin、p65、p-p65、IKBα、p-IKBα、GAPDH一抗過夜，并標(biāo)記相應(yīng)種屬的二抗30 min。4℃過夜后，室溫標(biāo)記相應(yīng)二抗30 min，使用ECL發(fā)光液檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平。

1.6 不同基因mRNA水平表達(dá)的檢測(cè) 采用RTPCR+qPCR檢測(cè)。細(xì)胞總RNA首先使用TRI-ZOL法提取，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄步驟：（1）gDNA Eraser Buffer+gDNA Eraser+Total RNA+H2O按照相應(yīng)比例混合后，42℃2 min；（2）第一步反應(yīng)混合液+PrimeScript RT Enzyme Mix I+RT Primer Mix+PrimeScript Buffer 2+H2O按照相應(yīng)比例混合后，37℃15 min，85℃5 s即得到cDNA文庫。隨后以GAPDH為內(nèi)參，SYBR染料法檢測(cè)mRNA表達(dá)水平的變化，15個(gè)基因qPCR引物序列如下Pla2g4a-F：ACGGTTCAGCATGGCACTGT，Pla2g4a-R：CCACCACAGGCACATCACGT，Tubg2-F：GAGGAGATGCACAGATCGAGG，Tubg2-R：GGACTGTGCTTCTTGTCCAGG，SPON1-F：CATGGTCCGAGTGGAGTGAC，SPON1-R：AGTCAATGGGGCATTCAGGG，TXLNB-F：AAAGCAACGAGGTGTTTGCC，TXLNB-R：GCTGGGCCTCTTTGAGTCTT，KIR3DL1-F：CCAGGTCCCCTGGTGAAATC，KIR3DL1-R：AAATTGGCCTTGGAGACCCC，SDHA-F：AACACTGGAGGAAGCACACC，SDHA-R：AGTAGGAGCGGATAGCAGGA，KIAA0-125-F：AGGACACTGACTTTGGCTAGGG，KIAA0125-R：TCACAGTGCTGTCCAGACCCAT，F(xiàn)AM83G-F：GCCCGCTCGATTGCTCA，F(xiàn)AM83G-R：CCAGACACTGCACCTGAGAG，ACOT7-F：CTAGCCACCATGGCTTTCCA，ACOT7-R：GAGACAGGAAGTCGGTGCG,ARPC5L-F：TCCTGGGGCTGTATAGGGAA，ARPC5L-R：TGTCCGCCACGTAACAGAAG，SLC2A5-F：GGCTTCTCCATCTGCCTCATAG，SLC2A5-R：GGAGATGACACAGACGATGCTG，SOCS1-F：TTCGCCCTTAGCGTGAAGATGG，SOCS1-R：TAGTGCTCCAGCAGCTCGAAGA，ATP13A2-F：GTTATCCAGGCTCTGCGAAGGA，ATP13A2-R：GTGGACGATGATCAGATGCTCC，CALCRL-F：TGGATGGCTCTGCTGGAACGAT，CALCRL-R：CCAGTTTCCATCTTGGTCACAGA，HECTD3-F：ATCGAGATCCGCATCGTGGAGT，HECTD3-R：TAGTTGGCTGGAACAGGTCTGC，內(nèi)參基因GAPDH-F：GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG，GAPDH-R：ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA，反應(yīng)體系與條件按照SYBR qPCR試劑盒說明書進(jìn)行，mRNA的相對(duì)表達(dá)量采用 2-ΔΔCT表示。

1.7 細(xì)胞增殖檢測(cè) 采用CCK-8法。首先將HECTD3-scramble與HECTD3-shRNA細(xì)胞鋪于96孔板中，并設(shè)立0、24、48、72、96 h時(shí)間點(diǎn)，每一時(shí)間點(diǎn)設(shè)立4副孔，每孔3 000個(gè)細(xì)胞，加入十分之一體積的CCK-8試劑后，37℃孵育3 h，并使用酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度（optical density,OD）450 nm的值，細(xì)胞增殖指數(shù)即為細(xì)胞OD 450 nm值與細(xì)胞在0 h時(shí)OD 450 nm值的比值。

1.8 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用Annexin V APC/PI雙染法。HECTD3-scramble與HECTD3-shRNA細(xì)胞在感染病毒48 h后，使用PBS洗2次，并使用100 μl binding buffer重懸，加入5 μl Annexin V APC抗體與5 μl PI染料，冰上孵育10 min后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 細(xì)胞周期檢測(cè) 采用高濃度PI染色法。HECTD3-scramble與HECTD3-shRNA細(xì)胞在感染病毒48 h后，使用PBS洗2次，加入700 μl無水乙醇與300 μl PBS+5% FBS重懸，-20℃固定過夜后，加入終濃度為1 μg/ml RNA酶，37℃水浴30 min后，加入終濃度為50 μg/ml PI染料，室溫避光標(biāo)記30 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。

1.10 NF-κB轉(zhuǎn)錄活性變化的檢測(cè) 采用EMSA檢測(cè)。HECTD3-scramble與HECTD3-shRNA細(xì)胞在感染病毒48 h后，使用核蛋白提取試劑盒提取核蛋白：（1）使用300 μl預(yù)冷 Hypotonic Buffer裂解 10 s，3 000 r/min 離心 5 min；（2）加入 400 μl預(yù)冷 Hypotonic Buffer裂解 30 s，500 r/min 離心 5 min；（3）200 μl lysis buffer裂解 20 min后，1 500 r/min 10 min，即得到裂解后的細(xì)胞核蛋白，隨后使用NF-κB探針、OCT-1探針進(jìn)行結(jié)合，在EMSA膠中進(jìn)行分離、紫外交聯(lián)，最后使用ECL發(fā)光液檢測(cè)NF-κB探針的強(qiáng)度與OCT-1探針強(qiáng)度的比值，并以該比值表示NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。

1.11 公共數(shù)據(jù)庫分析 采用R語言進(jìn)行數(shù)據(jù)庫分析，具體如下：（1）獲得癌癥基因組圖譜（TCGA）AML患者基因表達(dá)數(shù)據(jù)與相應(yīng)的臨床信息（http://gdac.broadinstitute.org/）；（2）去除RSEM值在60%樣本中表達(dá)量低于3的基因；（3）使用limma包中VOOM功能對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；（4）計(jì)算 z值；（5）使用 caret包將原始數(shù)據(jù)集按照0.8的比例分為訓(xùn)練數(shù)據(jù)集與驗(yàn)證數(shù)據(jù)集；（6）使用survival包中的單因素Cox回歸模型在訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中得到P＜0.0001的基因；（7）使用randomForest包對(duì)基因進(jìn)行特征重要性排序，隨機(jī)森林算法參數(shù)為nodesize=2、ntree=10 000、mtry=571、sampletype=swor、nsplit=10，在選取排名前15個(gè)基因后，使用多因素Cox回歸模型計(jì)算；（8）將得到的基因在測(cè)試數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用Cox回歸模型得到患者預(yù)后相關(guān)基因。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)后相關(guān)基因 首先調(diào)取TCGA中173例AML患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)與臨床信息，并按照4∶1的比例分為訓(xùn)練數(shù)據(jù)集與測(cè)試數(shù)據(jù)集，經(jīng)單因素Cox回歸模型得到116個(gè)預(yù)后相關(guān)的基因后，使用隨機(jī)森林算法對(duì)116個(gè)基因與患者生存率之間的關(guān)聯(lián)程度進(jìn)行排序；將訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中樹的數(shù)量提高到10 000后，算法在測(cè)試數(shù)據(jù)集中的錯(cuò)誤率逐漸降低（圖1a、b），通過重要性排序，初步明確了116個(gè)基因與患者總體生存率關(guān)聯(lián)程度（圖1c，見插頁），并最終選擇前15個(gè)與患者總體生存率相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)基因（表1），使用多因素Cox回歸模型計(jì)算預(yù)后指數(shù)，結(jié)果表明在訓(xùn)練數(shù)據(jù)集與測(cè)試數(shù)據(jù)集中，高風(fēng)險(xiǎn)患者生存率顯著低于低風(fēng)險(xiǎn)患者（圖1d）；在AML患者和健康志愿者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中測(cè)定上述15個(gè)基因表達(dá)水平，qPCR顯示以上15種基因均高表達(dá)于AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞（圖1e，見插頁）。

表1 15個(gè)預(yù)后相關(guān)基因與患者總體生存率之間的關(guān)系

圖1 Cox回歸模型得到15個(gè)預(yù)后相關(guān)的基因（a：使用Cox回歸模型篩選預(yù)后相關(guān)基因流程；b：檢測(cè)不同數(shù)量的樹中，隨機(jī)森林算法判定分類結(jié)果的錯(cuò)誤率變化，并待錯(cuò)誤率穩(wěn)定后，使用該數(shù)量的樹進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；d：得到15個(gè)預(yù)后相關(guān)基因在訓(xùn)練與驗(yàn)證數(shù)據(jù)集中對(duì)患者總體生存率的影響）

圖1 Cox回歸模型得到15個(gè)預(yù)后相關(guān)的基因[a：使用Cox回歸模型篩選預(yù)后相關(guān)基因流程；b：檢測(cè)不同數(shù)量的樹中，隨機(jī)森林算法判定分類結(jié)果的錯(cuò)誤率變化，并待錯(cuò)誤率穩(wěn)定后，使用該數(shù)量的樹進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；c：使用隨機(jī)森林算法對(duì)單因素Cox回歸分析得到的116個(gè)基因進(jìn)行重要性排序（顯示前52個(gè)基因）；d：得到15個(gè)預(yù)后相關(guān)基因在訓(xùn)練與驗(yàn)證數(shù)據(jù)集中對(duì)患者總體生存率的影響；e：健康志愿者與AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)qPCR檢測(cè)15個(gè)預(yù)后相關(guān)基因在mRNA水平的相對(duì)表達(dá)量]

2.2 15個(gè)預(yù)后相關(guān)基因的表達(dá)與驗(yàn)證 結(jié)果表明HECTD3在健康志愿者、AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中表達(dá)水平分別為1.00±0.10、5.83±0.24，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001），HECTD3在15個(gè)基因中的相對(duì)表達(dá)量最高，而在GSE12417中，HECTD3的高表達(dá)與患者總體生存率顯著相關(guān)（圖2a，見插頁）。HECTD3-shRNA在10 MOI下對(duì)AML-193具有很好的感染效率（圖2b，見插頁）。在使用qPCR與Western blot檢測(cè)HECTD3在mRNA與蛋白水平的變化后，HECTD3-scramble組與HECTD3-shRNA組HECTD3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.12、0.23±0.07，HECTD3-shRNA 降低了 HECTD3蛋白水平的表達(dá)（圖2c，見插頁）。

圖2 15個(gè)預(yù)后相關(guān)基因的篩選與驗(yàn)證（a：HECTD3基因在GSE12417數(shù)據(jù)集中與患者總體生存率之間的關(guān)聯(lián)；b：使用HECTD3-shRNA慢病毒感染AML-193細(xì)胞，感染病毒48 h后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP+細(xì)胞比例的變化；c：HECTD3-scramble與HECTD3-shRNA感染AML-193細(xì)胞48 h后，Western blot檢測(cè)HECTD3在蛋白水平表達(dá)的變化）

2.3 HECTD3的表達(dá)對(duì)AML-193細(xì)胞增殖、凋亡與細(xì)胞周期的影響 在確定HECTD3-shRNA具有很好的感染與敲除效率后，使用CCK-8檢測(cè)HECTD3敲低后細(xì)胞增殖的改變，結(jié)果表明HECTD3-scramble組與HECTD3-shRNA組在72 h時(shí)增殖指數(shù)分別為5.41±0.21、3.34±0.18，HECTD3-scramble組顯著高于 HECTD3-shRNA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），其余各時(shí)點(diǎn)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。在細(xì)胞凋亡中，HECTD3-scramble組與HECTD3-shRNA組ANNEXIN V+比例分別為 4.21±1.38、28.64±5.89，HECTD3-shRNA顯著高于HECTD3-scramble組（P＜0.001），在細(xì)胞周期中，HECTD3-scramble組與 HECTD3-shRNA組 G1期細(xì)胞比例分別為 30.56±5.61、51.61±6.12，HECTD3-shRNA組顯著高于HECTD3-scramble組（P＜0.001）。見圖3（插頁）。

表2 兩組細(xì)胞增殖指數(shù)的比較

圖3 HECTD3的表達(dá)對(duì)AML-193細(xì)胞增殖、凋亡與細(xì)胞周期的影響（a：使用Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化；b：使用高濃度PI染色法檢測(cè)細(xì)胞周期的變化）

2.4 HECTD3-shRNA對(duì)AML-193中NF-κB通路活性的影響 與HECTD3-scramble組比較，HECTD3-shRNA組泛素結(jié)合蛋白比例顯著降低，灰度值分別為7.91±1.68與 3.72±1.35，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。HECTD3-shRNA組p65磷酸化顯著降低，p65表達(dá)量并無明顯改變，抑制因子IKBα磷酸化水平降低，同時(shí)表達(dá)量升高；HECTD3-scramble組、HECTD3-shRNA組 NF-κB探針與OCT-1探針灰度值的比值分別為1.4±0.15、1.03±0.12，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），表明HECTD3-shRNA組NF-κB轉(zhuǎn)錄活性顯著降低。見圖4。

圖4 HECTD3-shRNA顯著抑制AML-193中NF-κB通路的活性（a：總泛素結(jié)合蛋白的變化；b：NF-κB通路p65磷酸化、總p65、抑制因子IKBα磷酸化、總IKBα的改變；c：NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的改變）

3 討論

AML是一種以骨髓性造血芽細(xì)胞異常增殖為特征的惡性腫瘤，可依據(jù)FAB分類分為M0～M7 8種亞型，目前是成人急性白血病中較常見的一種[5]。AML的預(yù)后與患者的細(xì)胞遺傳學(xué)、白血病細(xì)胞的染色體結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)，如在-5，-7，del（5q）型別患者中，預(yù)后顯著變差，特定的基因異常激活如FLT3、c-KIT、VEGFR等同樣能夠顯著影響患者預(yù)后[6]，應(yīng)用特異的激酶抑制劑如midostaurin能夠在特定的基因型患者中得到很好的效果[7]。因此尋找與患者預(yù)后相關(guān)的基因，并進(jìn)行特定的靶向治療具有很好的前景。

在本研究中，首先使用單因素Cox回歸模型得到116個(gè)與患者總體生存率顯著相關(guān)的基因，對(duì)于臨床決策與進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證而言，116個(gè)基因數(shù)量過龐大，而隨機(jī)森林能夠通過對(duì)平均不純度的衰竭來對(duì)特征的重要性進(jìn)行排序，且能夠通過加權(quán)表決的方式避免決策樹中常見的過擬合問題[8]。隨后使用隨機(jī)森林對(duì)基因表達(dá)重要性進(jìn)行排序，最終得到基于15個(gè)在訓(xùn)練、測(cè)試數(shù)據(jù)集中均有很好的表現(xiàn)的預(yù)后相關(guān)基因。在與現(xiàn)有預(yù)后相關(guān)標(biāo)志物進(jìn)行比較后，結(jié)果表明該15個(gè)預(yù)后基因與Li Z、Torrebadell的預(yù)后基因無任何重疊，本研究健康志愿者與AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中，HECTD3基因表達(dá)水平為15個(gè)基因中最高，同時(shí)HECTD3作為泛素E3結(jié)合酶[9]，與其具有相似功能的WWP1[10]、FBXO9[11]、RNF5[12]、TRAF2[13]均被證實(shí)與 AML發(fā)病相關(guān)，盡管HECTD3目前與血液系統(tǒng)腫瘤之間的關(guān)系尚未有報(bào)道，HECTD3已被證實(shí)在乳腺癌中高表達(dá)[9]，在食管鱗狀細(xì)胞癌中，HECTD3特異性的促進(jìn)Caspase9的泛素化，進(jìn)而抑制了Caspase9與Apaf-1的結(jié)合，從而促進(jìn)了食管癌細(xì)胞體內(nèi)與體外的增殖[14]。在AML-193 HECTD3-scramble與HECTD3-shRNA細(xì)胞系中，感染病毒72 h時(shí)，HECTD3-shRNA組細(xì)胞增殖指數(shù)顯著低于HECTD3-scramble，HECTD3-shRNA同時(shí)使得AML-193細(xì)胞凋亡比例增加、細(xì)胞周期中G1期細(xì)胞比例增加，證實(shí)了HECTD3對(duì)于維持細(xì)胞生存至關(guān)重要，可作為靶向治療的靶點(diǎn)。

基于HECTD3的功能，首先使用ubiquitin抗體檢測(cè)細(xì)胞泛素結(jié)合蛋白的變化，結(jié)果表明HECTD3的敲低使得泛素結(jié)合蛋白比例下降，而在之前的研究中，泛素結(jié)合蛋白比例的下降能夠誘導(dǎo)NF-κB通路的抑制[15]，而NF-κB同時(shí)也是AML發(fā)生、發(fā)展中重要的蛋白[16]，HECTD3的抑制則使得p65磷酸化降低、IKBα磷酸化首先，總IKBα表達(dá)顯著升高，HECTD3的抑制還使得NF-κB探針的信號(hào)強(qiáng)度降低，論證了HECTD3對(duì)NF-κB通路的維持作用，而HECTD3對(duì)AML細(xì)胞的作用則可能與NF-κB通路的改變。

綜上所述，本研究使用了Cox回歸模型、隨機(jī)森林相結(jié)合的方式，鑒定出預(yù)后相關(guān)的基因，并進(jìn)行了簡(jiǎn)單的功能、機(jī)制驗(yàn)證，為進(jìn)一步小分子抑制劑的開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。