微生物發酵青蒿葉和葉渣的研究

丁嘉偉 蘇新堯 尹薪項 馬婷玉 王晚晴 向麗 馮寶民 王彩霞

（1. 大連大學生命科學與技術學院，大連 116622；2. 中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700；3. 河北科為先生物科技有限公司，衡水053311；4. 北京聯合大學生物化學工程學院，北京 100023）

黃花蒿（Artemisia annuaLinn.），民間多稱青蒿，為一年生草本，菊科植物，莖直立，上部多分枝，具縱棱線。葉互生，莖中部的葉二回羽狀分裂，花蕾期采收，割取地上部分，切碎，曬干。青蒿具有清熱解暑、除蒸、截瘧功效。用于暑邪發熱，陰虛發熱，夜熱早涼，骨蒸勞熱，瘧疾寒熱，濕熱黃疸［1］。青蒿除含有抗瘧成分青蒿素、青蒿酯鈉、蒿甲醚等外，還含有青蒿酸、雙氫青蒿素、青蒿醇、青蒿乙素、左旋樟腦等，具有一定的降壓、平喘、解熱、鎮靜、抗炎、抗病毒、調節免疫功能等功效［2］。抗瘧藥物青蒿素即來自于黃花蒿，是中藥為數不多的一類新藥，其發現者屠呦呦先生也因此獲得諾貝爾獎。盡管青蒿知名度高，但是其在中藥行業用量不大，除了作為青蒿素提取的原料藥外，在動物養殖上有所應用（如青蒿散）。青蒿素提取工藝成熟、價格透明，因此提取青蒿素一般多選擇含量高的青蒿品種（1.5%-1.8%）用于降低成本。整體看來，我國青蒿種植及青蒿素原料藥制備企業利潤低，行業壓力大。在青蒿種植過程中，還有許多青蒿素等功效成分含量較低的青蒿，以及青蒿素提取產生的青蒿葉渣，不合理利用則會增加企業支出，造成青蒿資源浪費。近年來，研究發現青蒿素能夠有效對抗乙型肝炎、血吸蟲病、小細胞肺癌和耐藥性癌癥。青蒿作為粗飼料，因其具有特殊的香氣，適口性較好，不論豬、兔，夏季每天投喂200-400 g，能起到消除暑熱和健胃的作用，可使禽畜在炎熱天不掉膘，生長繁殖正常，增重快，且疾病少［3］。作為動物保健產品使用可提高動物免疫力，明顯抑制雞球蟲的生長和發育［4-5］。因此研究并開發上述青蒿及葉渣并積極尋求新的應用，對延長延伸青蒿保健產品的產業鏈具有重要意義。

目前市場上的青蒿類動物藥多為復方含青蒿藥材直接粉碎制備，產品利用率有待進一步提高。微生物尤其是益生菌發酵中藥，具有改善中藥苦味、降低藥材本身毒性等優點，發酵過程破壞藥材細胞結構，有利于功效成分釋放提高其利用率，還有助于將大分子物質降解為利用度更高的小肽、多糖等，增強動物吸收，發酵中藥中的益生菌本身對于可調節動物腸道健康，促進營物質的消化吸收。

本研究以青蒿葉和葉渣作為主要原料，采用微生物發酵模式，將青蒿葉和葉渣功效成分充分釋放，探索其作為動物保健產品的可能性，旨為拓寬青蒿原料的應用及產業鏈提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 實驗菌株保存于中國中醫科學院中藥所1 樓實驗室-80℃ 50%甘油管中。植物乳桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌均為益生菌，能夠改善動物腸道內環境；釀酒酵母菌、黑曲霉菌、里氏木霉菌有較好的發酵能力，常用在工業發酵中。實驗所用菌株生物特性見表1。

1.1.2 試劑 氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、石油醚、丙酮、硫酸均購買自北京化工廠有限責任公司；青蒿素及其衍生物標品購自成都埃法生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母粉購自索萊寶公司；標準酪蛋白購自美國BD 公司；青蒿葉與青蒿葉渣均由廣西仙草堂有限責任公司提供。

1.1.3 儀器 恒溫振蕩器：上海一恒科學儀器有限公司；紫外分光光度計UV-5100B：上海精密儀器；GCMS-QP20：日本島津；微量XPE/微量分析天平：梅特勒托利多國際貿易（上海）有限公司；漩渦震蕩器Vortex-1：上海滬析實業有限公司；真空濃縮機CONCENTRATOR PLUS：德國艾本德公司。

1.2 方法

1.2.1 種子液制備 里氏木霉、地衣芽孢桿菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、酵母菌和畢赤酵母菌菌液接種于30 mL LB（1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1%氯化鈉）培養基中（比例1∶50），活化兩次。取第二次活化菌液接種于100 mL LB 培養基中（比例1∶50），37℃培養24 h，其中酵母菌和畢赤酵母菌30℃培養24 h。

1.2.2 培養基組成成分 7.5 g 青蒿葉/青蒿葉渣、2.5 g 玉米漿、1.25 g 豆粕、1.25 g 麥麩、80 mL 無菌水，121℃濕熱滅菌30 min。

1.2.3 發酵 里氏木霉、地衣芽孢桿菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌酵、酵母菌和畢赤酵母菌單一菌種菌液接種量接于發酵培養基中（比例1∶50），37℃發酵5 d，其中酵母菌和畢赤酵母菌培養基30℃發酵5 d，每組3 個平行，青蒿葉和葉渣組加入等體積滅菌蒸餾水。每24 h 測定一次OD600，繪制菌株生長曲線。發酵結束后，樣品（105±2）℃烘干120 min，小型磨粉機粉碎至粉末，取0.2 g 粉末進行粗蛋白含量測定，取3.0 g 粉末進行粗纖維含量測定，取5.0 g 粉末進行粗脂肪含量測定。

1.2.4 粗纖維、粗蛋白、粗脂肪和功效成分含量測定 粗纖維的測定依據GB6432-86 方法進行［14］，粗脂肪的測定依據GB6433-1994 方法進行［15］，粗蛋白測定采用雙縮脲法進行［16］。

青蒿素、青蒿乙素、雙氫青蒿酸、青蒿酸提取及測定：準確稱取0.1 g 樣品放入50 mL 離心管，離心管中加入10 mL 石油醚，超聲萃取1 h，室溫靜置30 min，取9 mL 上清液，減壓濃縮制干［17］。GC-MS對青蒿素及其功效成分進行分析鑒定［18］，所用色譜儀為島津氣相色譜質譜聯用儀GCMS-QP2010，色譜柱為HP-5（30 mm×0.25 mm×0.25 mm），離子源為EI 源，離子源溫度溫度，280℃；載氣氦氣流速1.5 mL/min；進樣口溫度250℃，分流進樣，分流比1∶1，進樣量1 μL；柱箱程序升溫起始溫度100℃，保持1 min；然后以6℃/min 的速度升溫至220℃，保持3 min 后以30℃/min 的速度升溫至280℃，保持5 min；質譜掃描范圍35-500 m/z。

1.2.5 統計學分析 采用GraphPad Prism 7 軟件進行統計分析，數據用x-±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩組間比較采用LSD-t 法，P＜0.05 差異有統計學意義。

表1 供試菌種及其特性

2 結果

2.1 菌株生長曲線結果分析

如圖1 所示，青蒿葉和葉渣經菌株發酵后，整體呈上升-平穩-下降的趨勢。發酵菌株對數期主要集中于24-72 h，72 h 后培養基中的營養物質快速消耗，不足以維持菌株整體的生長發育，導致菌株生長發育受到抑制，OD600逐漸下降，其中里氏木霉和植物乳桿菌菌株生長情況最好。

2.2 青蒿葉和葉渣粗脂肪、粗蛋白、粗纖維含量測定

如圖2 示，粗蛋白和粗脂肪含量整體呈上升趨勢，粗纖維含量整體呈下降趨勢。發酵前后粗蛋白含量對比，釀酒酵母菌發酵青蒿葉后粗蛋白含量提高了75.59%（P＜0.05），提高最多，其次是地衣芽孢桿菌，其發酵后粗蛋白含量提高了69.28%（P＜0.05）；發酵前后粗脂肪含量對比，植物乳桿菌發酵青蒿葉后粗脂肪含量提高106%（P＜0.05），提高最多，其次是黑曲霉菌，發酵后其粗脂肪含量提高了74.32%（P＜0.05）；發酵前后粗纖維含量對比，枯草芽胞桿菌發酵后粗纖維含量降低了43.30%（P＜0.05），降低最多，其次是枯草芽孢桿菌，發酵后粗纖維含量降低了42.10%（P＜0.05）。發酵青蒿葉渣后粗蛋白含量對比，釀酒酵母菌發酵后粗蛋白含量提高了85.30%（P＜0.05），提高最多，其次是畢赤酵母菌，其發酵青蒿葉渣后粗蛋白含量提高了44.60%（P＜0.05）；植物乳桿菌和干酪乳桿菌粗脂肪含量提高了87.73%（P＜0.05），提高最多，其次是黑曲霉菌，發酵后粗脂肪含量提高了57.60%（P＜0.05）；枯草芽孢桿菌發酵后粗纖維含量降低了55.67%（P＜0.05），降低最多，其次是里氏木霉菌，發酵青蒿葉渣后粗纖維含量降低了43.04%（P＜0.05）。綜合上述數據看，說明釀酒酵母菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌在對粗蛋白、粗脂肪提高以及粗纖維降低方面最好，可用于發酵生產。

圖1 青蒿葉（A）和青蒿葉渣（B）發酵菌株的生長曲線

2.3 青蒿葉和葉渣發酵前后功效成分含量

青蒿葉和葉渣發酵后通過GC-MS 檢測，與混合標準品相比，青蒿發酵產物分別在14.914、15.470、18.848、19.334 min 出現與標準品相同質譜圖的新峰，見圖3 所示，比較青蒿發酵前后功效成分含量變化。

如圖4 所示，青蒿葉發酵后，雙氫青蒿酸、青蒿酸、青蒿乙素和青蒿素4 種功效成分含量顯著升高。與對照組比，枯草芽孢桿菌發酵后雙氫青蒿酸含量提高了86.01%（P＜0.05），地衣芽孢桿菌發酵后青蒿酸含量提高了21.49%（P＜0.05），黑曲霉菌發酵后青蒿乙素和青蒿素含量分別提高了88.06%（P＜0.05）、133.27%（P＜0.05）。黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌發酵青蒿葉后，青蒿4 種功效成分含量提升顯著。

如圖5 所示，青蒿葉渣發酵后，雙氫青蒿酸和青蒿乙素兩種功效成分整體呈上升趨勢。與對照組比較，枯草芽孢桿菌發酵后其雙氫青蒿酸含量提高了71.91%（P＜0.05），地衣芽孢桿菌發酵后其青蒿乙素含量提高了94.71%（P＜0.05）。青蒿葉渣經枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌發酵后，產物中青蒿成分含量提升明顯，地衣芽孢桿菌具有獨特的奪氧機制，不適合與好氧菌進行混合發酵。

3 討論

微生物發酵青蒿葉和葉渣，提高了粗蛋白、粗脂肪及青蒿素等功效成分含量，降低了粗纖維含量，使青蒿葉和葉渣中的功效成分得到充分釋放，增加了作為動物保健產品的可能性，為拓寬青蒿原料的應用及產業鏈提供理論依據。

中藥發酵產物作為動物飼料添加劑方面的應用價值較高，趙帥等［19］研究發現杜仲具有提高動物生產性能、增強機體免疫力、改善畜禽產品品質等多種功能，在日糧中添加發酵杜仲葉粉0.3%飼喂海蘭褐蛋雞，能夠顯著提升產蛋率2.7%，同時蛋重提高0.6%。喬宏興等［20］使用植物乳桿菌和屎腸球菌對中藥黃芪進行發酵，發酵后產物作為飼料添加劑飼喂斷奶仔豬，結果發現，0.6%發酵黃芪添加組斷奶仔豬的平均采食量顯著提高，證明發酵黃芪產物對斷奶仔豬有明顯的促生長作用。何玉華等［21］發現，在雉雞日糧中添加發酵水飛薊殘渣，可提高其采食量和營養物質消化率。根據中藥在飼料添加劑方面的應用價值與前景，探索開發青蒿葉和葉渣發酵產物作為動物保健品。

圖2 青蒿葉發酵后中粗蛋白（A）、粗脂肪（C）、粗纖維含量（E）、以及青蒿葉渣發酵后中粗蛋白（B）、粗脂肪（D）、粗纖維（F）含量

圖3 發酵產物中青蒿素等化合物GC-MS 分析確定

圖5 青蒿葉渣發酵后中雙氫青蒿酸（A）、青蒿乙素（B）含量

探索開發青蒿葉和葉渣發酵產物作為動物保健品，功效成分含量的多少對動物的生長發育其關鍵性作用。飼料中粗纖維含量多少同樣影響著動物的生長發育，粗纖維含量低，使飼料體積減小，功效成分含量提高，普遍適口性好［22］。里氏木霉、枯草芽孢桿菌能在含有青蒿葉和葉渣的培養基中較好生長，可產生大量的纖維素酶、糖化酶、淀粉酶及植酸酶等酶類，有利于細胞壁的破碎，從而使青蒿葉和葉渣中的功效成分得到充分釋放［23］。粗蛋白在機體內以多種小分子蛋白、游離氨基酸和肽發揮作用，是機體內重要的營養元素，可提高機體免疫力，增強氧化分解功能。釀酒酵母菌以及植物乳桿菌等自身含有大量多種蛋白質、氨基酸、微生物等多種營養成分，常用于工業飼料領域，可大量提高發酵產物中蛋白質含量。李漠等［24］研究發現，飼糧中粗蛋白含量升高，貉血清中游離的蘇氨酸、蛋氨酸、賴氨酸等總氨基酸含量均明顯升高，有利于貉的生長發育，為冬毛期獲得大張幅皮張奠定基礎。粗脂肪含量是判定飼料產品質量和等級的重要指標。根據菌株生長曲線可知，植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌在培養基中的生長情況較好，能夠快速生長并積累大量的粗脂肪。植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌作為益生菌具有調節免疫力，抑制致病菌，降低血清膽固醇含量和預防心血管疾病，維持腸道內菌群平衡等保健作用。

綜上所述，黑曲霉菌發酵青蒿葉和葉渣使青蒿素和青蒿乙素含量提高最多，但是在發酵過程中可產生黑曲霉毒素，需要引起注意。釀酒酵母菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌在粗蛋白、粗脂肪提高以及降低粗纖維方面較好，可用于發酵生產。青蒿葉和葉渣通過微生物發酵模式，可大幅度提高功效成分含量，充分發揮藥用價值，探索開發新的產品應用于多領域當中，可使中藥資源得到充分利用。

4 結論

本研究通過微生物液態發酵青蒿葉和葉渣，發酵后粗蛋白、粗脂肪、青蒿素、雙氫青蒿酸、青蒿乙素和青蒿酸的含量均較對照組有所提高，粗纖維含量均較對照組有所降低。青蒿葉和葉渣經釀酒酵母菌發酵后產物中粗蛋白含量均最高，經植物乳桿菌發酵后產物中粗脂肪含量均最高，經枯草芽孢桿菌發酵后產物中粗纖維含量均降低最多。該研究結果為今后進一步探索工廠化發酵生產青蒿動物保健產品提供參考依據。