皮克林乳液酶反應體系的構建與應用研究進展

徐劉佳 鄭明明

（中國農業科學院油料作物研究所 油料脂質化學與營養湖北省重點實驗室 農業農村部油料加工重點實驗室，武漢430062）

酶是一種高效的生物催化劑，可用于多種化學反應，由于具有較強的選擇性、催化效率高、綠色環保等優點，受到越來越多的關注［1-3］。在酶反應體系中，反應底物通常溶于有機溶劑，酶則需要一定的水相環境才能發揮其催化活性［4］。因此，酶促反應往往發生在有機-水雙相體系的界面上［5］。然而，雙相體系中的酶促反應往往受到依賴于界面面積的傳質過程的限制［6］。

皮克林乳液是Pickering［7］于1907 年第一次在公開出版物上描述的一種由固體顆粒穩定的乳狀液。固體顆粒緊密排列在油水界面，一旦進入界面就會形成不可逆吸附，促使兩相界面張力降低，在液滴之間形成一定的靜電斥力和空間位阻，從而起到阻礙油滴合并變大的作用。皮克林乳液的類型由固體顆粒的濕潤性來控制，而濕潤性可通過油水界面上的三相接觸角（θ）體現。如圖1 所示［8］，當θ＜90°時，顆粒相對親水，容易制得水包油（O/W）型乳液；當θ 接近90°時，顆粒具有兩親性，既可以形成水包油乳液又可以形成油包水乳液；當 θ ＞90°，顆粒相對親油，容易制得油包水（W/O）乳液。皮克林乳液具有高的抗聚結性，并且顆粒易于分離、成本低、毒性小，因此皮克林乳液正逐漸成為設計高效雙相生物催化反應體系的創新平臺［9-11］。

本文總結了常用于穩定皮克林乳液的固體顆粒，詳細的舉例了皮克林乳液在酶反應體系中的應用情況，并對此反應體系做了簡單的展望，旨在為發展更高效、綠色的酶催化反應提供更多的思路。

圖1 固體顆粒在三相界面的接觸角示意圖［8］

1 皮克林乳液的穩定劑

作為皮克林乳液的穩定劑，固體顆粒的濕潤性［8］、粒徑大小［12］、表面電荷［13］、顆粒的濃度［14］對乳液的穩定性都會產生影響。因此，本節總結了一些常用來穩定皮克林乳液的固體顆粒的性質及表面改性對乳液穩定的影響。

1.1 硅納米顆粒

納米二氧化硅屬于無機納米材料，無毒、無味且無污染。1992 年，Kresge［15］首次提出了介孔二氧化硅納米粒子概念，介孔二氧化硅納米材料具有較大的比表面積、有序可調的介孔結構和穩定的理化性質［16-18］，而且它可以很容易的與多種官能團連接進行表面修飾。在藥物輸送、吸附、催化轉化等領域具有良好的應用前景。大量實驗表明，由于Si-OH 基團在粒子表面的親水性，未改性的二氧化硅傾向于穩定O/W 皮克林乳液，而改性后的二氧化硅顆粒則優先穩定W/O 皮克林乳液［19］。Meng等［20］制備了具有可調節潤濕性的載酶介孔二氧化硅顆粒（LMSPs），通過改變接枝硅烷的鏈長，可以對LMSPs 的潤濕性進行微調，從而優化皮克林乳液的界面面積。Ren 等［21］制備一種動態共價二氧化硅（SiO2-B），僅通過改變溶液pH 值即可實現皮克林乳液的形成與分離。在今后的研究中，二氧化硅納米顆粒在改性方面仍然有巨大的發展空間，不僅是對其形態、尺寸、親疏水性的改變，還有通過表面改性制備更多響應性質的功能基團，用于需要破乳的雙相反應、石油回收、化妝品的油性去除等等。

1.2 碳納米顆粒

碳元素是自然界中存在的最重要的元素之一，以碳為基礎的納米材料是多種多樣的，包括常見的石墨和金剛石，還包括近幾年比較熱門的碳納米管、碳納米線、富勒烯和石墨烯等新型碳納米材料。碳納米材料因其化學穩定性高、導電性好、價格低廉等優點，已廣泛應用在吸附、電化學、催化等領域中。Dong 等［22］制備了直徑為350 nm、孔徑分布有序的介孔碳球并成功穩定皮克林乳液，對此碳球進行硝酸化改性，結果顯示硝酸化雖然會降低碳球的比表面積和孔容，但經過硝酸化的介孔碳球功能基團較多，改變了載體的微環境，更適合用于酶的固定化。Diaz de Tuesta 等［23］采用乙烯，乙烯/乙腈作為碳前體和碳/氮前體合成碳納米管進行皮克林乳液界面催化，展示了制備的兩親性碳納米管的高催化性能。

1.3 磁性納米顆粒

磁性納米材料由于具有易分離的特點，受到了不少研究者的青睞。Zhou 等［24］以經典共沉淀法制備超順磁Fe3O4納米粒子，作為皮克林乳液的穩定劑，考察了粒子濃度、油/水體積比、油極性等因素對功能性乳劑的類型、穩定性、組成和形貌的影響。研究表明，對于親水的Fe3O4納米顆粒，非極性和弱極性油有利于形成穩定的O/W 型乳液，液滴的平均尺寸隨著油的體積分數增大和粒子濃度的降低而增大，乳液穩定性下降。Xie 等［25］制備了一種光磁雙響應的皮克林乳狀液微反應器，利用二氧化鈦（TiO2）納米粒子在紫外線照射下潤濕性會改變的特點，將TiO2納米粒子和磁性Fe3O4納米顆粒結合，預先包封不同反應物的液滴，在外加磁場的作用下，彼此靠得很近，由于液滴的聚結合并，使孤立的反應物接觸，從而在紫外線照射下發生化學反應。實現了一種以非侵入性和良好控制的方式觸發化學反應的方法。

1.4 天然穩定劑

1.4.1 淀粉 淀粉是一種可以從多種植物資源中提取的天然物質。淀粉顆粒具有可生物降解、無毒等優點，是食品工業、生物醫藥等領域的理想選擇。然而，淀粉顆粒的粒徑范圍較大，并且天然淀粉顆粒不具有疏水性，因此在乳化過程中一般不適合吸附在油水界面上［26］，需要對其進行表面改性才能更成功地穩定O/W 皮克林乳液。Li 等［27］用辛烯基琥珀酸對淀粉球晶，大米淀粉，蠟質玉米淀粉和蠟質馬鈴薯淀粉4 種淀粉進行改性。如表1 所示，淀粉顆粒經辛烯基琥珀酰化后，顆粒的接觸角明顯增大，顆粒粒徑變小，乳化性能變好。Ge 等［28］以不同大小的玉米、木薯、甘薯和糯玉米淀粉納米粒子作為穩定劑制備了皮克林乳狀液，研究發現木薯、紅薯和玉米淀粉納米顆粒近中性濕潤，更適合皮克林乳液穩定。另外結果還顯示甘薯和玉米淀粉納米顆粒直徑在100-220 nm 范圍內穩定的皮克林乳液，其穩定性要優于直徑小于100 nm 或大于220 nm 顆粒所穩定的皮克林乳液，說明淀粉顆粒可能在一定的大小范圍內才具有良好的穩定能力。

1.4.2 大豆蛋白 大豆蛋白是一種植物性蛋白質，來源廣泛，營養豐富。其中，大豆分離蛋白是大豆蛋白最商業化的一種產品。在大豆分離蛋白的商業化生產過程中，大豆分離蛋白中的球蛋白很容易發生變性，因此大多數球蛋白以聚集體的形式存在。聚集體蛋白除了具有不溶性外，還表現出良好的表面活性［29］。此外，它們適用于高壓乳化形成更細小的液滴［30］，這使大豆分離蛋白有望成為一種有效的皮克林乳液穩定劑。Liu 等［29］首次報道了具有良好乳化性能的熱誘導大豆蛋白聚集體。將大豆分離蛋白經95℃加熱15 min，然后加入NaCl 進行靜電篩選，形成納米顆粒聚集體。所制備的納米聚集體粒徑為100 nm，相較與未加熱的大豆分離蛋白疏水性更強，并且乳液穩定性隨油的比例增加而增加。乳化穩定性的提高主要與加熱后凝膠狀網狀物的形成有關，這種網狀物可以將油滴圈閉在網狀物中。在另一項研究中，Ju 等［31］利用大豆分離蛋白和花青素制備新型皮克林乳狀液。大豆分離蛋白納米顆粒能夠穩定乳液和泡沫，花青素可以降低顆粒直徑，將他們通過共價鍵復合可以減小大豆分離蛋白的粒徑，提高乳液的穩定性和抗氧化活性。近年來，也有不少用多酚類等活性物質和蛋白質結合作為穩定皮克林乳液的穩定劑。另外，還有將蛋白與纖維素顆粒結合的穩定乳液的研究［32-33］。這些研究可能對基于蛋白質的乳液配方的設計和制造，甚至對具有某些獨特功能的大豆蛋白產品的開發具有重要意義。

1.4.3 纖維素 纖維素納米顆粒（包括晶體和纖化纖維）可由可再生資源（如植物廢料和木漿）持續生產，或由細菌乙氧基桿菌生物合成。纖維素可分散在水中，在乳液中起物理穩定劑的作用，吸附在油水界面。Li 等［14］利用從芒草中提取的纖維素納米纖維（CNFs）成功地制備了一種高穩定性的皮克林乳液。隨著均質次數的增加，CNFs 的持水能力明顯增強。此外，較高的CNFs 含量也能顯著提高乳液的穩定性。Li 等［34］還利用細菌纖維素的乳化能力和茶多酚優秀的抗氧化能力，制備了茶多酚改性的細菌纖維素（TPs/BC）納米纖維，并將其作為油水乳化液的皮克林乳化劑。TPs/BC 納米纖維除了具有穩定乳劑的物理性質和對脂質氧化的保護作用外，還可以通過與自由基結合或減少自由基從而起到抗氧化的作用。

表1 不同種類淀粉改性前后的顆粒尺寸與三相接觸角［27］

2 皮克林乳液在酶促反應中的應用

酶是具有高度選擇性的生物催化劑，因其需要一定的水環境而在許多反應中受到了限制。皮克林乳液酶反應體系中應用的最多的酶是脂肪酶，大多數脂肪酶具有“界面效應”，只有在油相和水相的界面處才能發揮催化作用［22］。將皮克林乳液應用到脂肪酶催化的反應中可提供更大的界面面積，加快界面傳質，是建立高效催化的多相酶反應體系的絕佳方案。目前皮克林酶反應體系主要分為兩大類：一是游離酶皮克林乳液反應體系；二是固定化酶皮克林乳液反應體系。

2.1 游離酶

游離酶皮克林乳液反應體系是先將游離酶溶解于一定量的水相中，加入穩定劑和有機相進行機械攪拌，得到一個在皮克林乳液體系中由游離酶催化的化學反應體系。Yu 等［35］用氨基修飾的二氧化硅顆粒作為皮克林乳液的穩定劑，并將其用于脂肪酶CRL 催化的橄欖油水解等雙相生物催化反應中，結果顯示在皮克林乳液中橄欖油水解的轉化率可達到91%，相較于機械攪拌的無溶劑體系中轉換率提高了20%。另外，結果還顯示在單獨添加了表面活性劑與二氧化硅的反應體系中，轉換率分別降低為58%和10%，這可能是因為脂肪酶與表面活性劑或二氧化硅納米顆粒之間的某些相互作用導致酶的變性和催化活性的降低。在未均質僅僅使用機械攪拌的兩相體系中，轉化率也僅僅只有17%。在皮克林乳液中高的轉化率說明表面活性劑的負面作用在皮克林乳狀液中得到了明顯抑制，而且皮克林乳液可以大大提高雙相體系中界面催化的效率。雖然皮克林乳液在游離酶催化反應中 可以大大提高多相體系中界面催化的效率，但同時存在著不易回收、酶容易失活等缺點，產物中若存在水溶性物質，就很難將游離酶分離出來，這使工業生產會付出較高的成本。這種方法更適用于較為便宜的商品化酶，僅僅只需要利用皮克林乳液來加快反應速度、提高轉化率，在反應完成后，分離固體顆粒滅酶即可。

2.2 固定化酶

相較于游離酶皮克林乳液反應體系，固定化酶皮克林乳液體系具有更大的工業應用潛力。固定化酶皮克林乳液反應體系是將皮克林乳液的穩定劑同時作為酶的固定化載體，在這種情況下，酶在皮克林乳液界面的位置使油-酶-水界面面積最大化，不僅加快了反應速度，提高了轉化率，同時酶的固定化也可以一定程度上提高酶的穩定性，避免酶的失活，方便酶的回收再利用［36-37］。近年來報道的固定化酶皮克林乳液反應體系如表2 所示。

Dong 等［22］將脂肪酶AYS 吸附固定在介孔碳球上制備了皮克林乳液，并成功應用于植物甾醇和α-亞麻酸的酯化反應中，在此反應體系中轉化率高達92%，反應時間只需1.5 h，催化效率是雙相體系的5.6倍，并且固定化酶重復利用10 次以后，轉化率依舊高達90%以上，而游離酶在反應4 次之后基本沒有活力，該反應體系不僅具有高效快速的催化性能，而且還具有良好的操作穩定性和重復性。Wang 等［38］制備了一種用來穩定皮克林乳液的共聚物納米顆粒，并構建了游離酶和固定化酶兩種皮克林乳液反應體系。以甲苯為有機相，對1-己醇與己酸的酯化反應進行了研究。結果表明，在兩種皮克林乳劑的平衡狀態下，反應的轉化率達到了80%-90%，并且固定化酶反應體系中脂肪酶顯示出更高的比活性，這是由于固定在聚合體管腔內的脂肪酶全部分布在皮克林乳狀液的界面上，與前者相比，酶的利用率得到了提高。Yang 等［39］考慮酶與載體之間吸附作用較弱，酶容易發生浸出或變性，用共價交聯固定化酶時，酶的活性會不可避免的降低的問題，開發了一種具有表面活性的海藻酸鹽粒子，將酶以綠色的方式包封在微粒中，通過調節接枝二氧化鈦納米粒子的碳鏈長度，可使高度親水的海藻酸鹽微粒子易于微調，具有適當的潤濕性，從而穩定目標乳液。由于其微膠囊化條件溫和、微環境生物相容性好、油水界面面積大、擴散距離短，將其用于以正己烷為油相，1-己醇與己酸的酯化反應，結果證實了在此反應體系中脂肪酶催化活性高、穩定性好。此外，通過重力沉降可以很容易地分離出含有產物/底物的有機相，從而使皮克林乳液可以被回收并重復使用多個循環。但以包封的方式固定化酶不利于酶活性中心的暴露，因此選擇一個合適的固定化方法可以有效提高酶催化性能。

固定化酶皮克林乳液反應體系既發揮了皮克林乳液最大化了界面催化的反應面積的作用，又結合了固定化酶穩定性高，易于回收的優點。可以預見，此反應體系在綠色催化領域有巨大的應用潛力。

表2 近年來報道的固定化酶皮克林乳液反應體系

3 “開關”調控皮克林乳液酶反應體系

在介紹皮克林乳液穩定劑時已簡單提到了一些具有環境響應能力的乳液。在這里我們稱之為開關型皮克林乳液。當受到一定的環境刺激時，穩定皮克林乳液的固體顆粒顯示出一定表面活性（開），當撤去或改變外部環境的刺激，固體顆粒失去表面活性（關）。開關型皮克林乳液在催化反應中有很大的優勢，在這種智能體系中，粒子的表面濕潤性很容易受到外部環境刺激的調節。因此，開關型皮克林乳液可以以一種簡單、綠色的方式達到破乳效果。將開關型皮克林乳液用于酶促反應，可以控制反應進行，解決過于穩定的皮克林乳液反應體系中產物的分離和酶的回收。近些年，關于開關型的皮克林乳液也有不少的研究，根據調控手段的類型可大概分為CO2/N2、電化學、磁場、pH、溫度、光調控等。

3.1 CO2/N2調控

CO2/N2由于便宜，且對環境無害的特點，在生物催化中特別有吸引力。此外，CO2和N2對酶幾乎沒有損傷，而且可以通過簡單的操作很容易的將他們從反應體系中除去。Yu 等［35］在DMA-CO2疏水氧化硅納米顆粒穩定的水包油皮克林乳液中進行橄欖油的水解反應。在反應時，向溶液中通入CO2，乳液中的N，N-二甲基十二胺（DMA）發生質子化，轉變成碳酸氫鹽結構，形成顆粒具有一定的表面活性。在反應結束時，室溫下通過鼓泡N2，溶解的CO2被鼓出，碳酸氫鹽結構被破壞，使DMA-CO2 變為DMA（中性），顆粒失去表面活性從而達到破乳的效果。此時含有產物的油相可以很容易地分離，而水相中的脂肪酶CRL 和二氧化硅納米顆粒可以循環利用。與離心或超濾等其他分離乳劑的方法相比，使用N2/CO2的方法可以使工業化生產中的大規模操作變得容易，不需要特殊或昂貴的設備。酶和顆粒的破乳和回收可以通過在室溫下鼓泡N2來實現。

3.2 電化學調控

電化學調控作用的皮克林乳液固體顆粒中常含有氧化還原活性中心，在電化學刺激或外加氧化劑、還原劑作用下，其氧化還原活性中心可在氧化態和還原態之間發生可逆轉換，從而實現該物質在“有表面活性”和“無表面活性”之間的切換。Peng 等［44］利用二茂鐵基團和β-環糊精的功能化聚合物自組裝制備得到具有氧化還原響應性的微凝膠，微凝膠的形成和變形可以通過外部電位來調節，從而使皮克林乳液具有電化學控制的可逆性。以脂肪酶PCL 催化三乙酸乙酯水解，動力學拆分（R，S）-1-苯乙醇為模型。在三乙酸乙酯的水解反應中，PCL 在乳液體系中的比活性是在簡單的兩相體系中的兩倍多。在（R，S）-1-苯乙醇的動力拆分中，乳液體系中的轉化率也遠遠高于兩相體系中的轉化率。并且反應結束后，通過施加一個0.8 V 的電壓，微凝膠顆粒被解體，乳液被破壞，這是因為二茂鐵基團在電化學作用下發生氧化還原反應，電子的得失影響顆粒的親疏水性。此時水相和有機相分離，產物分散在有機相中，酶分散在水相中，當重新向水相中加入溶劑和底物，再施加一個0.2 V 的電壓時，經過均質，又重新形成皮克林乳液，進行下一個反應循環。三次循環后的脂肪酶的反應活性仍然高于兩相體系。

3.3 其他調控

目前還有許多以pH［45-46］、光［47-48］、熱［49-50］等為觸發器的開關型皮克林乳液。其中以pH 的應用最為廣泛，在這種皮克林乳化劑的分子結構中，通常含有可離子化的基團，如胺基、羧基等，通過調節體系的pH，上述基團可結合或失去質子，從而使結構發生改變，進而調控顆粒表面的親疏水性［46］。Huang 等［51］使用適當的pH 響應的納米顆粒作為催化劑和乳化劑用于皮克林乳液中的加氫反應，在反應開始時將常規的雙相體系轉化為油包水皮克林乳液體系。反應結束后，通過加入酸來破乳，從而發生宏觀相分離。但是少有文獻記載將pH 調控的開關型皮克林乳液用于酶促反應中，因為大多數酶對pH 敏感，容易發生構象變化引起酶的失活。同樣的，對于通過光和溫度調控的開關型皮克林乳液，由于這些因素都容易引起酶的失活，因此目前幾乎沒有文獻報道這種開關型皮克林乳液在酶反應體系中的應用，在這里不再做詳細介紹。對于磁響應的皮克林乳液，單一的磁響應在束縛能的限制下無法達到顆粒快速回收的目的［52］，而且對于反應中如何通過給予合適的磁場破乳及破乳后再形成皮克林乳液，目前尚未有過明確的報道。現有的技術通常是將磁響應與其他響應相結合以形成開關型皮克林乳液［25］。因此如何解決這些環境刺激對酶結構的影響有待研究者們進一步研究。

4 總結與展望

皮克林乳液酶反應體系克服了雙相體系中酶的界面催化傳質阻力大、反應效率低、酶容易失活等缺點，為綠色化學領域的發展提供了一個新的方向，具有廣闊的工業應用前景。然而，皮克林乳液酶反應體系目前還處于初步探索階段，仍有許多的問題亟待解決。（1）大多數天然穩定劑來源有限，且在油水界面不具有良好的潤濕性，需要通過一定的化學改性才能使乳液穩定，因此尋求具有油相和水相都具有良好的潤濕性的天然穩定劑將是未來的發展趨勢。（2）酶固定化載體具有嚴格的限制條件，因此制備的穩定劑同時也要具備良好的固載能力，使乳劑同時發揮穩定劑和催化劑的作用，減輕反應體系的“負擔”。（3）開關型皮克林乳液可以有效的控制破乳，但在酶反應體系中由于酶易受到環境的影響而限制了其應用，如何發展具有環境響應的皮克林乳液酶反應體系有待研究者們進一步探究。