慢性乙肝合并肺結核患者外周血單個核細胞HBV pgRNA的表達與免疫功能的相關性

張志鋒 薛珉 徐瑞芳 張紅云 張曹庚

我國是乙肝病毒(HBV)高感染國家，又是肺結核高負擔國家，慢性乙肝(CHB)合并肺結核患者在臨床上并不少見，此類患者病情復雜，治療難度更大。流行病學研究顯示，CHB合并肺結核行抗結核治療肝功能損害的發生率約為30%～50%，嚴重者可誘發急性肝衰竭，嚴重影響抗癆治療和病情進展[1]。目前，抗結核藥物導致HBV再激活已形成廣泛共識，HBV活躍復制誘導機體處于炎癥狀態，從而改變肝臟解毒功能并增加藥物的肝臟毒性，進一步加重抗結核所致肝損傷[2-3]。近年來，有研究指出血清HBV RNA是被包裹的前基因組RNA(pgRNA)，以類似于HBV樣病毒顆粒存在，且與cccDNA狀態密切相關，對于CHB再復制、抗病毒治療的療效評估具有重要價值[4]。本研究擬通過檢測CHB合并肺結核患者外周血HBV pgRNA的表達，分析其與免疫功能的相關性，現報告如下。

資料與方法

一、一般資料

選取2018年3月-2019年3月我院結核門診新確診的CHB合并肺結核患者，共40例。入組標準：①CHB診斷均符合中華醫學會肝病學分會聯合感染病學分會制定的《慢性乙型肝炎診斷標準(2015年版)》[5]。②肺結核病診斷依據《肺結核診斷標準(WS 288—2017)》[6]：a.痰結核菌陽性；b.明顯低熱、盜汗、咳嗽、咯血等結核中毒癥狀； c.病理檢測陽性或痰抗酸桿菌PCR檢測陽性；d.胸部CT有典型的結核影像改變；e.抗結核治療有效。具備以上第1項或2～5項中3項者可診斷為結核。③年齡18～60歲，肺結核均為首次確診，既往未接受過抗結核治療。排除標準：①合并存在艾滋病病毒感染、糖尿病、自身免疫性疾病者；②既往急性或亞急性肝衰竭病史者、或其他重要臟器功能衰竭病史者；③明確診斷為非結核分枝桿菌感染者。其中男26例，女14例；年齡38～60歲，平均(48.5±6.2)歲；CHB病程1～25年，平均(10.7±2.6)年。按照隨機數字表法，將患者分為對照組(n=20)、治療組(n=20)。兩組年齡、性別、病程等比較，差異均無統計學意義(t/χ2=0.51,1.75, 0.25，P>0.05)。本研究符合《赫爾辛基宣言》，入選對象均簽署知情同意書。

二、方法

對照組給予2HRZE/4HR 方案，即異煙肼(H，山西汾河制藥有限公司，國藥準字H14022402)0.4g/次、利福平(R，廣東華南藥業集團有限公司，國藥準字H44020771)0.60g/次、吡嗪酰胺(Z，廣東華南藥業集團有限公司，國藥準字H44020761)1.5 g/次、乙胺丁醇(廣東華南藥業集團有限公司，國藥準字H44020758)0.75 g/次，總療程6個月。治療過程定期檢測肝功能，當谷丙轉氨酶(ALT)指標升高時口服甘草酸二銨0.15g護肝治療，持續到治療全部結束。觀察組在此基礎上定期給予拉米夫定進行預防性抗病毒治療，100 mg/次，1次/天，連續治療6個月。

三、觀察指標

1 標本采集:分別于治療2、6個月后采集適量清晨空腹肘靜脈血，肝素抗凝，送實驗室備檢。

2 HBV DNA、HBV RNA定量檢測:取2 mL肝素抗凝靜脈血，按常規方法用淋巴細胞分離液分離出外周血單核細胞(PBMCs)，與乙型肝炎病毒核酸定量測定試劑盒(湖南圣湘生物科技有限公司)充分混合、裂解，分別提取PBMCs中HBV DNA、HBV RNA，采用ABI 7000實時免疫熒光定量PCR儀(美國ABI公司)進行PCR、RT-PCR。試劑盒檢測下限為200 copies/mL。

四、統計學方法

結 果

一、兩組不同時間PBMCs中HBV DNA、HBV RNA比較

治療前，兩組PBMCs中HBV DNA、HBV RNA水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；治療后2個月，兩組PBMCs中HBV DNA、HBV RNA水平較治療前顯著升高，治療組治療后6個月PBMCs中HBV DNA、HBV RNA水平較治療后2個月顯著下降，與治療前比較均無顯著性差異(P>0.05)，且均顯著低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)(見表1)。

二、兩組不同時間T淋巴細胞、IFN-γ水平比較

表1 兩組不同時間PBMCs中HBV DNA、HBV RNA比較 log copies/mL)

表2 兩組不同時間T淋巴細胞、IFN-γ水平比較

三、HBV DNA、HBV RNA與免疫功能指標的相關性

表3 PBMCs中HBV DNA、HBV RNA與免疫功能指標的相關性

討 論

目前，肺結核的臨床治療方案已經較為成熟，但對肺結核合并CHB患者如何在確保治療效果同時減輕對肝功能的損害，一直是該領域臨床醫生關注的熱點問題[7]。HBV再激活是指HBV病毒攜帶者在接受細胞毒性藥物或免疫抑制劑等治療后HBV復制力增強，是繼發藥物性肝損害主要原因之一，其發生機制復雜，化療、免疫抑制劑可直接或間接促進HBV復制，但對于抗結核治療過程中出現的HBV再激活尚缺乏足夠證據[8]。研究表明，PBMCs作為免疫細胞，其感染HBV可能與CHB病情反復加重或某些病理條件作用有關，被視為HBV再激活的基礎[1]。

近年來研究表明，ccc DNA為模板反轉錄合成RNA是病毒復制的開端，也是反復感染的關鍵因素，徹底清除ccc DNA才能治愈CHB，但ccc DNA檢測侵入性的局限性極大限制其發展與應用[9]。PBMCs中HBV RNA主要為pg RNA，其來源可能為HBV復制過程中核衣殼包裹的pg RNA未進行逆轉錄時獲得包膜并從感染的肝細胞中釋放入血，被稱為HBV RNA病毒樣顆粒，可以反映cccDNA水平及轉錄活性，可作為指導抗病毒治療及安全停藥的一個生物標志物[10-11]。根據臨床經驗，HBV治療1個月可開始激活，1.5～2個月達到高峰，因此治療后2個月檢測能夠有效反映病毒再激活現象。本研究結果顯示，兩組抗結核治療后2個月PBMCs中HBV DNA、HBV RNA表達較治療前顯著升高，提示該時期HBV出現大量復制、再激活，而治療組治療后6個月PBMCs中HBV DNA、HBV RNA水平明顯回落，恢復至治療前水平，且顯著低于對照組(P<0.05)，說明預防性應用抗病毒治療有助于抑制HBV再激活，降低HBV pgRNA載量，進而降低抗結核治療過程的肝損傷[12]。

綜上所述，預防性抗病毒治療可有效降低PBMCs中HBV pgRNA表達，抑制抗結核治療過程中CHB再激活，改善機體免疫功能，同時免疫學變化可能參與了CHB再激活，但其具體機制仍有待進一步研究。