缺氧誘導因子-1α對非小細胞肺癌血管生成及其對預后的影響

王寶財 金壽德 張新

肺癌是我國常見惡性腫瘤，其死亡率和發病率居于惡性腫瘤首位，其中85%為非小細胞肺癌。目前治療方法包括分子靶向治療、化療、放療、免疫治療、手術、中醫中藥治療等。非小細胞肺癌確診時普遍已經發展至中晚期，失去根治性手術最佳時機，中晚期患者放化療后中位生存期也僅有10～11個月，3年生存率約為5%[1-2]。分子靶向藥物存在繼發性和原發性耐藥還，不能克服復發轉移。腫瘤發生、發展、復發、轉移均與腫瘤微環境有關，腫瘤微環境包括了免疫因子、新生血管、腫瘤間質、內皮細胞等，包括了缺氧微環境、酸性微環境、免疫抑制微環境。研究發現在氧氣充足情況下可通過糖酵解而非氧化磷酸化為腫瘤細胞提供能量，腫瘤新生血管缺乏、腫瘤血管結構異常、腫瘤快速進展會導致腫瘤微環境缺氧并產生大量酸性代謝物質，腫瘤處于缺氧環境，在這種狀態下，HIF-1α通過調整血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及糖酵解途徑促使腫瘤新生血管和血管密度增加[3-4]。但目前關于HIF-1a高表達與非小細胞肺癌病情、腫瘤血管新生和預后的研究升高，尚不能斷定HIF-1α促使非小細胞肺癌癌灶供血血管新生、病情進展和不良預后。為此筆者開展研究分析HIF-α對非小細胞肺癌病情、腫瘤血管新生和預后的影響，為今后該病治療方法和預后評估方法改進提供參考，現報道研究如下。

資料與方法

一、一般資料

采用回顧性研究，納入筆者醫院2014年8月-2016年2月期間收治的100例非小細胞肺癌患者。納入標準[5-6]：①病理學證實的非小細胞肺癌，留取癌灶組織標本并檢測本研究中指標。②手術初治療，術前未進行放化療及其他抗腫瘤治療，術后根據美國國家綜合癌癥網絡指南進行對應輔助治療。③KPS評分≥70分，ECOG評分≤1分；18歲～80歲；術后生存時間≥3個月；患者及其監護人簽署知情同意書。排除標準：①嚴重腎、肝、腦、心等基礎疾病；②嚴重感染性疾病、自身免疫性疾病、其他惡性腫瘤；③精神疾病是；④哺乳期及妊娠期女性。分期參考國際抗癌聯盟第8版肺癌TNM分期標準。本研究獲得醫院倫理委員會支持。 男性78例，女性22例；患者年齡為33～78歲，平均(64.98±10.23)歲；TNM分期Ⅰ期18例，Ⅱ期28例，Ⅲ期30例；腺癌29例，鱗癌71例；高分化23例，中度分化32例，低分化45例，其中47例患者有淋巴結轉移。

二、方法

1 分組方法：根據HIF-1α陰陽性分組，陽性為HIF-1α陽性組，陰性為HIF-1α陰性組。

2 組織切片制備：手術切除癌癥組織，使用10%中性緩沖福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋，切片厚度4 μm，撈貼組織切片，制作成小切片組織標本。

3 石蠟切片免疫組化染色： 將組織切片脫蠟水化。用自來水、蒸餾水沖刷20s，用PBS緩沖液洗滌3次，每次3min。使用EDTA抗原(福州邁新生物技術開發公司產品，編號MVS-009/0099)修復液煮沸抗原修復法修復切片。完成以上步驟后取出切片再用PBS緩沖液洗滌3次，每次3min；將組織載玻片放入濃度為3%的H2O2溶液中5～10 min，滅除內源性過氧化氫酶，再次用PBS緩沖液進行相同方法的洗滌；將載玻片組織除外的地方擦拭干凈，加一抗，確保一抗與組織完全接觸，無氣泡，浸潤組織但組織表面不能有液體。加一抗后切片置入單獨卵育盒中育1.5h，清除一抗，再次用PBS緩沖液沖洗切片，沖洗3次，每次3 min。在組織切片上加聚合物增強劑，其要求與加一抗的要求相同，室溫孵育15～20min，以上操作完成后將載玻片置入PBS緩沖液沖刷3次，每次3min，加辣根標記物，滴加要求與一抗一致，室溫孵育15～20min，再次使用PBS緩沖液沖刷，要求同上。向載玻片加顯色液，染色2～10min，DAB顯色時間為5min左右，蘇木素復染30s，染好的切片脫水處理，用二甲苯溶液透明，再使用中性樹膠封片。

4 陰性、陽性判斷：HIF-1α抗體來自福州邁新生物技術開發公司，一抗稀釋濃度為1 ∶100，陰性對照使用PBS代替一抗，嚴格按照試劑盒說明書染色。HIF-1α細胞核或細胞質為黃(褐)色顆粒表示陽性。綜合染色強度及陽性細胞百分比定性，陽性細胞率為≤5%為0分，5%～25%記錄1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色強度：無染色為0分，呈淡黃色記錄1分，棕黃色記2分，深棕色或深褐色為3分；綜合染色強度和陽性細胞百分比乘積為最終結果，≥5分為陽性。VEGF、(Vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)、(Angiopoietin-2，Ang-2)陽性判斷參考等研究者發表的論文[7]。

三、觀察指標

分析HIF-1α在不同性別、年齡、TNM分析、組織學類型、淋巴結轉移、分化程度中的陽性率；對比HIF-1α陽性組和陰性組患者VEGF、VEGFR2、Ang-2陽性率；對比HIF-1α陽性組和HIF-1α陰性組患者治療1年轉移+復發率、死亡率，分析HIF-1α、VEGF、VEGFR2、Ang-2陽性表達與非小細胞肺癌患者不良預后(轉移=死亡+復發)的關系，統計HIF-1α陽性組和HIF-1α陰性組患者無病生存時間。

四、統計學分析

結 果

一、HIF-1α、Ang在非小細胞肺癌患者中的表達情況

Ang-2以及HIF-1α在不同性別、年齡、組織學類型中陽性率比較差異無統計學意義，P>0.05；Ang-2以及TNMⅢ期高陽性率均出現在TNMⅠ+Ⅱ期、有淋巴結轉移的患者、低分化程度的患者中，P<0.05(見表1、圖1)。

表1 HIF-1α在非小細胞肺癌患者中的表達情況

圖1 HIF-1α、Ang在非小細胞肺癌患者中的表達情(SP×200)

二、非小細胞肺癌患者治療前，癌組織HIF-1α陽性組與陰性組VEGF、VEGFR2、Ang-2表達情況

HIF-1α陽性組VEGF陽性率為97.45%、VEGFR2陽性率為78.08%，均較HIF-1α陰性組VEGF陽性率(51.85%)、VEGFR2陰性率(48.15%)高，P<0.05。HIF-1α陽性組Ang-2陽性率為72.60%，HIF-1α陰性組Ang-2陽性率為33.33%，P<0.05(見表2)。

表2 治療前癌組織HIF-1α陽性組與陰性組VEGF、VEGFR2、Ang-2陽性率對比(n，%)

三、HIF陽性表達與非小細胞肺癌患者治療1年預后情況

HIF-1α陽性組轉移+復發率為17.34%，HIF-1α陰性組轉移+復發率為5%，χ2=4.98，P=0.0003；死亡患者中HIF-1α陽性組患者占比為66.78%(4/6)，HIF-α陰性組患者占比為(33%)，χ2=23.17，P<0.001。

四、HIF-1α、VEGF、VEGFR2、Ang-2表達與非小細胞肺癌預后的Logistic回歸分析

HIF-1α陽性、VEGF陽性、VEGFR2陽性、Ang-2陽性是非小細胞肺癌不良預后的獨立因素，P<0.05(見表3)。

表3 HIF-1α、VEGF、VEGFR2陽性與非小細胞肺癌不良預后的關系

五、HIF-1α陽性與陰性表達組患者生存時間對比

HIF-1α陽性表達組平均無病生存時間為11.23±2.54個月，HIF-1α陰性表達組平均無病生存時間為31.23±5.98個月，χ2=14.77(P<0.001)(見圖2)。

圖2 HIF-1α陽性與陰性表達組患者生存時間對比

討 論

非小細胞肺癌的發生、發展、轉移、復發均與腫瘤微環境有關，而血管生成受缺氧環境影響，腫瘤血管生成通常經血管生成因子啟動，血管生成因子彌散在腫瘤血管中，激活正常靜止狀態的血管細胞，促使內皮細胞朝著血管刺激方向移動、降低基底膜蛋白、促使內皮細胞增殖、形成管腔、覆蓋周細胞、產生新基底膜[8]。Ang是近年來發現的經內皮細胞特異性酪氨酸受體Tie-2發揮作用的生長因子家族，在血管生成、發育、成熟和通透性中均有調節作用，Ang包括Ang-1和Ang-2，Ang-1能降低內皮細胞通透性對VEGF介導的血管通透性和血管生成作用上有抑制作用，提高內皮細胞穩定性[9]；而Ang-2與Ang-1相反，Ang-2特異性結合血管內皮細胞Tie-2受體，與Ang-1競爭，利于VEGF作用發揮，是腫瘤血管新生和強化的重要因素，與腫瘤血管數目、分期、預后相關，但目前尚不知哪些機制激活了Ang-2過表達[10]。而近年來一些研究指出腫瘤壞死邊緣和周邊侵襲區往往存在供血不足，腫瘤處于缺血缺氧狀態，這可能是Ang-2過表達的原因[11-12]。VEGF和VEGF受體是血管生成重要促成因子，是HIF2靶基因之一，特異性結合血管內皮細胞，促使內皮細胞生長，提高血管通透性，協助腫瘤細胞進入脈管系統并轉移。本研究通過分析HIF-1α與非小細胞肺癌患者Ang-2、VEGF、VEGFR2的關系分析HIF-1α對腫瘤血管新生和預后的影響。

HIF-1α是缺氧誘導產生的特異DNA結合蛋白，缺氧時其降解緩慢，胞內水平升高并向細胞核轉移，與HIF-1β結合為活性HIF-1二聚體，結合到靶基因啟動因子或增強子缺氧反應元件上，使靶基因轉錄啟動，參與缺氧反應基因調節，促使細胞適應低氧環境，生成新血管。本研究中HIF-1α陽性率和Ang-2陽性率均集中在TNMⅢ期、有淋巴結轉移、低分化程度的患者中，P<0.05。提示病情更重的非小細胞肺癌患者HIF-1α表達更高，HIF-1α與Ang-2密切相關。本研究中HIF-1α陽性組Ang-2陽性率較HIF-1α陰性組高，在Logstic回歸分析中發現HIF-1α、Ang-2陽性均表示預后不良風險高，HIF-α陽性組患者無病生存平均時間較HIF-α陰性組短，P<0.05。符杰[13]等研究者指出，缺氧狀態下非小細胞癌組織Ang-2 mRNA表達隨著HIF-1α升高而升高，缺氧后12h二者達到峰值，之后均逐漸降低。與本研究結果一致。Shan Xiuying[14]等研究者發現在隨訪1年的復發或轉移非小細胞肺癌患者(17例)中，15例患者HIF-1α為陽性，2例HIF-1α為陰性，且HIF-1α、VEGF、VEGFR2表達水平與轉移、復發相關，是不良預后的危險因素。與本研究結果一致。而本研究中HIF-α陽性組VEGF和VEGFR2陽性率均較HIF-α陰性組高，P<0.05。提示HIF-1α可能通過提高Ang-2，與Ang-1競爭，為VEGF和VEGFR2作用提供便利，從而促進腫瘤血管生成。

結合近年來關于HIF-1α、Ang-2、VEGF在惡性腫瘤中的表達研究，筆者認為HIF-1α導致非小細胞肺癌不良預后的機制可能為：①HIF-1α介導缺氧信號和缺氧誘導基因轉錄，缺氧環境下HIF-1α蛋白分子中部ODD區域脯氨酸殘基羥化反應被抑制，從而導致HIF-1α降解緩慢或不降解，胞內HIF-1α蛋白聚集，導致腫瘤組織中HIF-1α高表達，引起下游靶基因表達和產物增加，提高糖酵解效率、促血管生成、增加葡萄糖轉運等使腫瘤細胞在缺氧環境中維持生存，抵抗缺氧損傷，使得術后殘留的癌細胞在治療期間存活率提高，為之后腫瘤細胞的轉移提供保障[15-16]。②HIF-1α升高促使Ang-2高水平，拮抗Ang-1的血管穩定作用，導致內皮細胞與血管周圍支持細胞的相互作用被破壞，激活內皮細胞，但缺乏VEGF配合，促使內皮細胞凋亡，血管破壞，缺乏血供導致大量腫瘤細胞死亡，殘留腫瘤細胞受缺氧環境刺激，大量分泌VEGF，組織中VEGF和VEGFR2升高，促使被激活的內皮細胞遷移、增殖，形成新血管來克服腫瘤缺氧缺血現狀，使腫瘤細胞再次增殖[17-18]。③HIF-1α在術后殘留腫瘤組織中呈高表達，促使Ang-2持續高表達，從而阻止腫瘤血管分化與成熟，上調腫瘤基質中MMPs表達，促使腫瘤基質降解和腫瘤新生血管壁變薄、出血，形成高壓，這種高壓促使腫瘤細胞擴散和轉移，同時對抗癌藥物進入和通過造成阻礙，從而促使腫瘤細胞轉移并降低抗癌效果，促使病情惡化[19-20]。

綜上，缺氧誘導因子HIF-1α可能通過激活Ang-2，促使VEGF大量釋放，調控腫瘤血管，為殘留的腫瘤繼續存活、生長和轉移提供條件，導致不良預后。因條件限制，本研究未能對HIF-1α和Ang-2進行動態觀察，今后需要彌補此不足；此外關于HIF-α與Ang-2、VEGF的相互作用還不十分確定，這也是今后進一步研究的方向。