腫瘤相關成纖維細胞外泌體調控PI3K/AKT/mTOR信號通路影響肺癌細胞的生長和轉移

關靖 王皓 周俊 劉旭

惡性腫瘤是造成死亡的最主要原因，肺癌作為惡性腫瘤之一，其發病率高達17%，是目前發病率第一的惡性腫瘤，嚴重威脅人類的健康[1-2]。目前，肺癌的治療方法除了傳統的手術治療外，還有化療和放療，但腫瘤化療耐藥、放療敏感性降低、腫瘤復發、腫瘤轉移等問題一直阻礙著肺癌的臨床治療[3-5]，所以急需探究更多的腫瘤發生發展機制，尋找新型的腫瘤診斷和治療靶點。

外泌體是由多種活細胞分泌的粒徑在30～100 nm之間的納米級囊泡，可在體液中穩定存在而發揮細胞間信息傳遞的作用。腫瘤相關成纖維細胞是腫瘤微環境中的重要組成部分，可調控腫瘤的生長和轉移，其中腫瘤相關成纖維細胞外泌體，已經被研究在肝癌和膠質瘤中發揮重要的調控作用，然而其在肺癌中尚無研究，所以本文主要探究了腫瘤相關成纖維細胞外泌體對肺癌細胞的生長和轉移的作用，旨在為肺癌的臨床治療和研究提供幫助。

資料與方法

一、材料

人肺癌細胞A549(中國科學院上海細胞庫)；收集20例肺癌患者的組織樣本(經我院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書)，Transwell小室(福麥斯生物技術有限公司)；CCK8試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒(沈陽萬類生物技術有限公司)；α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、GAPDH一抗、IgG二抗(武漢三鷹生物技術有限公司)。

二、細胞分離與培養

肺癌細胞的培養：取液氮保存的肺癌細胞A549，于37 ℃水浴鍋中迅速解凍，然后接種于100 mm2的細胞培養皿中，于細胞培養箱中培養，細胞生長至匯合率達80%時，加入胰蛋白酶消化，進行細胞傳代。

原代成纖維細胞和腫瘤相關成纖維細胞的分離：從手術室取出肺癌組織和癌旁組織，用無菌的PBS溶液沖洗3次，然后在超凈工作臺中，將組織樣本剪碎，用膠原酶、中性蛋白酶、透明質酸酶的混合溶液消化30～50 min，1 500 rpm離心5 min，組織沉淀用少量12% FBS的DMEM/F12完全培養基重懸，并接種于細胞培養皿中，培養3天后更換培養基，洗掉組織碎片和沒有貼壁的細胞。培養通過胰蛋白酶消化的方法除去上皮細胞，留下成纖維細胞。

三、Western blot

消化各組細胞1×107個消化于離心管中，使用RIPA蛋白裂解液，提取細胞總蛋白，根據BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，然后加入上樣緩沖液沸水浴30 min，使蛋白變性，然后進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，用5%的脫脂牛奶對PVDF膜封閉2 h，然后以1 ∶1 000比例稀釋后的一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育1.5 h，再用TBST洗膜后按照ECL試劑盒說明書配置發光液，并將PVDF膜浸入發光液中反應半分鐘，曝光并拍照，用Image J軟件對曝光結果進行定量分析。

四、NFs和CAFs鑒定

Western blot和免疫熒光檢測NFs和CAFs中α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin表達，免疫熒光主要步驟為：將細胞接種至激光共聚焦皿中，使用4%的甲醛溶液固定，然后加入血清封閉2 h，加入適量α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin一抗，37 ℃孵育1 h；然后用PBS 漂洗，以洗去多余抗體，然后加入適量濃度的帶有CY3標記的二抗溶液，37 ℃室溫孵育1 h，然后使用DAPI染細胞核，然后于激光共聚焦顯微鏡下觀察蛋白表達。

五、外泌體的提取與鑒定

使用差速離心法提取細胞培養上清中的外泌體，首先將細胞培養基更換為含10%無外泌體胎牛血清的完全培養基，培養48 h后收集細胞培養上清，將上清液3 000×g，4 ℃離心15 min去除死細胞；然后將上清液6 000×g離心40 min，去除細胞碎片；10 000×g離心1 h，取上清；100 000×g離心1 h，收集沉淀即為外泌體，用400 μl PBS重懸外泌體，并放在-80 ℃保存。

外泌體的鑒定：于透射電鏡下觀察外泌體的結構特征，Western blot檢測外泌體標志蛋白CD9、CD63、TSG101。

六、CCK8實驗

CCK8實驗檢測細胞增殖能力，用含無外泌體胎牛血清的DMEM完全培養基將A549細胞稀釋至1×105個/mL，96孔板中每孔接種100 μl上述細胞，每孔加入外泌體，使其終濃度為10 μg/mL，每組5個復孔，并設置24、48、72 h時間點的96孔板，然后將上述96孔板于細胞培養箱中培養，在各時間點取出96孔板，每孔加入10 μl CCK8溶液，37 ℃條件下孵育4 h，然后使用酶標儀在450 nm波長條件下檢測各空光密度值(OD值)。

七、細胞遷移實驗

使用不含胎牛血清的DMEM培養基稀釋A549細胞，細胞細胞接種至Transwell小室中，每孔1×104個/200 μl細胞，每孔加入外泌體，使其終濃度為10 μg/mL，小室放置于24孔板，24孔板每孔加入600 μl DMEM完全培養基，然后將24孔板置于細胞培養箱中24 h，Transwell小室底部用結晶紫染色10 min，然后在顯微鏡下觀察并拍照，比較各組細胞遷移數。

八、細胞侵襲實驗

用Transwell小室法檢測細胞侵襲能力，主要過程為：將Matrigel膠4 ℃融化后，取20 μl平鋪于Transwell小室中然后置于37 ℃培養箱中凝固1 h，用DMEM空白培養基重懸A549細胞，細胞接種至Transwell小室中，每孔1×104個200 μl細胞，每孔加入外泌體，使其終濃度為10 μg/mL，小室放置于24孔板，24孔板每孔加入600 μl DMEM完全培養基，然后將24孔板置于細胞培養箱中24 h，Transwell小室底部用結晶紫染色10 min，然后在顯微鏡下觀察并拍照，比較各組細胞侵襲數。

九、細胞凋亡實驗

將A549細胞與各組外泌體共孵育24 h后，根據細胞凋亡檢測試劑盒，取5×105個細胞于離心管中，用500 μl的Binding Buffer重懸細胞成單細胞懸液，而后添加5 μl的Annexin V-FLTC和5 μl的PI染料，混勻后室溫避光孵育15 min，并設置Annexin V-FLTC和PI單陽性管用于調熒光補償，空白管用于調電壓；使用流式細胞儀檢測上述各樣品的熒光值，使用FlowJo v5.573軟件分析細胞凋亡數。

十、統計學分析

結 果

一、腫瘤相關成纖維細胞的鑒定

免疫熒光檢測和Western blot檢測α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin表達結果(見圖1、2)，所提取的CAFs表達α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin，而NFs細胞中α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin表達較弱，符合CAFs和NFs的特征，說明所提取的CAFs和NFs可用于后續研究。

二、外泌體鑒定結果

透射電鏡觀察外泌體結果(見圖3)顯示，所提取的外泌體粒徑在30～100nm之間，具有雙層膜結構，形態呈“杯托”樣，符合外泌體的結構特征，Western blot檢測外泌體標志蛋白CD9、CD63、TSG101(見圖4)。所提取的外泌體表達CD9、CD63、TSG101，符合外泌體的生物學特征。

圖1 免疫熒光鑒定CAFs和NFs結果(×20)

圖2 Western blot鑒定CAFs和NFs細胞α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin表達

圖3 透射電鏡觀察外泌體形態結構

圖4 Western blot檢測外泌體CD9、CD63、TSG101表達

三、CAFs外泌體促進肺癌細胞增殖

為了探究CAFs外泌體對A549細胞增殖能力的影響，將PBS、NFs exo、CAFs exo與A549細胞共孵育，CCK8法檢測細胞增殖能力的變化，結果(見圖5)，相比于PBS組，NFs exo組A549細胞增殖能力無顯著差異，CAFs exo組A549細胞增殖能力顯著增加(P<0.001)，說明CAFs外泌體能夠顯著促進肺癌細胞的增殖。

四、CAFs外泌體促進肺癌細胞遷移

Transwell小室法檢測細胞遷移結果(見圖6)顯示。相比于PBS組，NFs exo組A549細胞遷移能力無顯著變化(P>0.05)，而與CAFs exo共孵育后A549細胞遷移能力顯著增加(P<0.001)，提示腫瘤相關成纖維細胞外泌體能夠顯著促進肺癌細胞的遷移能力。

圖5 CCK8法檢測外泌體對A549細胞增殖能力的影響 (與PBS組相比，***P<0.001)

五、CAFs外泌體促進肺癌細胞侵襲

Transwell小室法檢測腫瘤相關成纖維細胞外泌體對A549細胞的影響，檢測結果(見圖7)。與NFs exo共孵育后，A549細胞侵襲能力無顯著變化(P>0.05)，與CAFs exo共孵育后A549細胞侵襲能力顯著增加(P<0.001)，說明腫瘤相關成纖維細胞外泌體能夠顯著促進肺癌細胞的侵襲能力。

六、CAFs外泌體抑制肺癌細胞凋亡

流式細胞術檢測細胞凋亡結果(見圖8)顯示，與NFs外泌體共孵育后A549細胞凋亡水平與PBS組相比無顯著變化(P>0.05)，與CAFs外泌體共孵育后，A549細胞凋亡水平顯著低于PBS組(P<0.001)，說明腫瘤相關成纖維細胞外泌體能夠抑制肺癌細胞凋亡。

圖6 細胞遷移實驗檢測外泌體對A549對細胞遷移能力的影響(與PBS組相比，***P<0.001)(×20)

圖7 細胞侵襲實驗檢測外泌體對A549細胞侵襲能力的影響(與PBS組相比，***P<0.001)(×20)

圖8 流式細胞術檢測外泌體對各組細胞凋亡水平的影響(與PBS組相比，***P<0.001)

七、CAFs外泌體激活PI3K/AKT/mTOR信號通路

Western blot檢測外泌體對PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響，結果如圖9所示，相比于PBS組，NFs exo組A549細胞中PI3K、AKT、mTOR磷酸化水平無顯著差異(P>0.05)，CAFs exo組A549細胞中PI3K、AKT、mTOR磷酸化水平顯著增加(P<0.001)，說明CAFs外泌體可激活PI3K/AKT/mTOR信號通路而促進肺癌細胞的生長和轉移。

圖9 Western blot檢測外泌體對PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響(與PBS組相比，***P<0.001)

討 論

CAFs是肺癌腫瘤微環境的的重要基質細胞之一[6]，可通過旁分泌在腫瘤的生長、轉移、血管新生、免疫逃逸、腫瘤耐藥中發揮重要的調控作用[7-8]，CAFs可重塑細胞外基質結構以及腫瘤微環境而調控腫瘤的發生發展[9]。腫瘤微環境中的多種基質細胞均可通過分泌外泌體，局部或全身性的參與細胞間的信息傳遞，CAFs和腫瘤細胞之間也可通過外泌體進行信息交流，進而影響腫瘤的發生發展[10-11]。如食管癌CAFs可以通過分泌外泌體而調控食管癌細胞的粘附、細胞內吞以及細胞連接等[12]。在胰腺癌中，CAFs外泌體可調控胰腺癌的增殖和吉西他濱的耐藥[13]。然而CAFs外泌體對肺癌的影響尚無報道，所以本文將研究定位于肺癌中CAFs分泌的外泌體對肺癌細胞生長和轉移的研究，旨在發現腫瘤微環境調控肺癌的新機制。

本研究首先分別從肺癌組織和癌旁組織中提取分離了纖維細胞，然后利用免疫熒光和Western blot鑒定了CAFs中高表達α-SMA、FSP-1、FAP、Vimentin，說明肺癌組織中的成纖維細胞為腫瘤相關成纖維細胞，為了探究CAFs外泌體的功能，體外培養CAFs和NFs后收集細胞培養上清，提取并鑒定外泌體后將外泌體與肺癌細胞A549細胞共孵育，檢測外泌體對肺癌細胞增殖、遷移、侵襲、細胞凋亡的影響，結果顯示，CAFs細胞所分泌的外泌體能夠顯著促進A549細胞增殖、遷移和侵襲能力，降低A549細胞的凋亡水平，而NFs外泌體對A549細胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡則無顯著影響，說明CAFs外泌體能夠調控肺癌細胞的生長和轉移能力。

PI3K/AKT/mTOR信號通路是腫瘤研究中的經典信號通路[14-15]，已經被證明可在多種腫瘤中異常激活，該通路的異常激活可引起腫瘤的異常轉化、促進腫瘤的生長和轉移，影響腫瘤血管新生等，在腫瘤的臨床治療中該通路的關鍵因子的活化還可作為評價患者預后的指標[16-17]，已有研究表明，非小細胞肺癌中PI3K、AKT、mTOR基因表達均上調[18-20]。本研究發現，CAFs外泌體與A549細胞共孵育后，A549細胞中PI3K、AKT、mTOR磷酸化水平均顯著增加，即PI3K/AKT/mTOR信號通路激活，而NFs外泌體則對該通路無顯著影響，說明腫瘤相關成纖維細胞能夠通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路而促進肺癌的生長和轉移。

綜上所述，在肺癌中，腫瘤相關成纖維細胞分泌的外泌體能夠促進肺癌的生長及轉移，其機制為激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，但是外泌體中何種物質發揮的調控功能，還需進一步研究。