基于轉錄組學數據對肝細胞癌的研究

楊慶芳 彭 彥 郭 飛 張澤立 楊慶霞

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，以下簡稱肝癌）是常見的消化系統惡性腫瘤之一，具有浸潤性強，易轉移、易復發的特點，并且預后差，死亡率高。其發生和發展是一個多因素、多步驟的復雜過程，受環境及自身因素的影響。目前還缺少有效的治療方法，并且發病機制尚未完全明了。在肝癌的各項致癌因素中，肝硬化是導致肝癌的主要病因。在臨床上，幾乎所有被診斷為肝癌的患者都有肝硬化的病史[1]。針對肝硬化患者的篩查項目有助于診斷出早期肝癌[2]。盡管已經有很多研究被開展，實現對肝癌的早期診斷，并揭示肝癌的發生發展機制。比如Zheng團隊[3]研究發現，SFN 蛋白在癌前病變組織和肝癌組織的蛋白表達譜有顯著差異，并且在肝癌組織高表達，該結果提示SFN 蛋白可能在肝癌的發生中起到作用，可作為肝癌早期診斷的生物標志物。然而，由于缺少對肝硬化到肝癌這一惡化階段基因組層面的分析，目前尚無在肝硬化人群中診斷出早期肝癌的有效方法[4]?；诖耍狙芯客ㄟ^轉錄組學的肝癌數據，應用差異表達基因進行基因本體學和信號通路的富集分析，初步探討肝癌發生發展過程中所參與的生物過程及信號通路。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本研究所選取的樣本為GEO 數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中的GSE17548數據集，共包括17 個肝癌樣本，20 個肝硬化樣本數據。肝癌和肝硬化組織RNA 樣品的微陣列分析是基于Gene Chip Human Genome U133 Plus 2.0 陣列的Affymetrix 平臺。將CEL 文件下載后，是基于R 語言（http://www.r-project.org）平臺進行分析，包括原始數據的讀取和數據的歸一化等預處理。

1.2 差異表達基因識別 對于GEO 下載的標準化后的數據，我們用DESeq2 軟件包（DESeq2 package 1.16.1）進行差異表達的分析。DESeq2 包中提供的統計程序，是基于負二項式分布的模型來確定基因表達數據中的差異表達。使用Benjamini 和Hochberg的方法來調整所得的P 值以控制錯誤出現率，最終將調整后的P＜0.05 以及log2FC＞2 作為顯著差異表達的閾值，挑選的基因作為差異表達基因。

1.3 差異表達基因功能分析 使用TopGO 軟件包（TopGO package 2.34.0）對所篩選出來的差異基因，進行基因本體學（Gene Oncology，GO）分析。按照P＜0.05 的標準，篩選出參與肝癌的生物進程的GO 條目。對識別的差異表達基因進行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genomes）通路富集分析。應用cluster－Profiler R 軟件包分析KEGG 通路，從分子水平的信息中了解生物系統的功能和效用。

2 結果

2.1 差異表達基因識別 對17 個肝癌樣本和20 個肝硬化樣本的轉錄組學數據進行分析，通過差異表達基因分析，以揭示肝癌組與肝硬化組的差異。以ttest 顯著檢驗所得P 值的對數值-lg（p-value）為縱坐標，以差異倍數的對數值log2（fold change，FC）為橫坐標繪制火山圖（見圖1）。紅點表示肝癌組織組相比于肝硬化組織組上調mRNA，藍點表示肝癌組織組相比于肝硬化組織組下調，灰點表示未顯著差異表達mRNA。以差異倍數FC＞2 和P＜0.05 為篩選閾值篩選差異表達基因，得出差異表達的基因共486 個。相對于肝硬化組織組，肝癌組織組有157 個基因上調，329 個基因下調（見表1），分別列舉了肝癌組織相對肝硬化組織高表達和低表達的前20 個基因。

圖1 差異表達基因的火山圖

表1 肝癌和肝硬化組織差異表達基因前20

對表1 中的肝癌和肝硬化組織差異表達的20個基因進行聚類分析（見圖2），在肝癌中差異表達的基因明顯分成了兩個部分，上調的基因聚在一起，下調的基因聚在一起。此外，基本上所有的肝癌樣本和肝硬化樣本也被區分開來。從這個聚類圖可以看到，所篩選的這20 個基因，在肝癌樣本和肝硬化具有較好的分類能力。

圖2 差異表達基因的聚類分析熱圖

2.2 差異表達基因功能和通路富集分析 為了探究差異表達基因在肝癌和肝硬化發病中的生物學過程及其功能，將FC＞2 且P＜0.05 的差異基因進行GO富集分析（見圖3），列舉了前十個顯著的GO 條目。差異表達基因顯著富集到Cell cycle（細胞周期）、Cell division（細胞分裂）、Mitosis（有絲分裂）、Arachidonic acid metabolism（花生四烯酸代謝）等一系列跟癌癥的發生發展密切相關GO 功能條目。

本研究利用KEGG 通路富集分析來找尋差異表達基因參與調控的相關通路（見表2）。研究發現，差異表達基因主要集中在Retinol metabolism（視黃醇代謝）、Chemical carcinogenesis（化學致癌作用）、Drug metabolism-cytochrome P450（藥物代謝-細胞色素P450）、Cell cycle（細胞周期）、p53 signaling pathway（p53 信號通路）、Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450（細胞色素P450 對外源物質的代謝）等16 個信號通路上。

圖3 差異表達基因GO 富集分析

3 討論

目前，肝癌發病機制及分子調控機制尚不明確。普遍認為是一個多基因參與、多步驟改變的復雜過程，目前缺乏有效的早期診斷手段。雖然，近年肝癌的生存率有所提高，但五年生存率仍不到10%。因此，早期及時發現和正確診斷肝癌對提高其根治率、改善患者預后具有重要意義。研究發現，促癌基因激活和（或）抑癌基因失活能使基因表達異常，導致細胞增殖及凋亡混亂，進而促進腫瘤的發生發展[5-6]。因此對這些變化的基因進行研究，或許能為肝癌的診療提供幫助。從轉錄組學角度來看，高通量測序可以通過分析樣品中的全部RNA，進而對細胞中的轉錄組變化規律進行系統研究。將其應用于肝癌研究，能在分子層面鑒定與肝癌臨床表型有關的樞紐基因，為進一步探索肝癌發病機制提供新的思路和理論基礎，對理解肝癌分子遺傳基礎也具有重要意義。

表2 KEGG 分析差異表達基因參與的信號通路

本研究利用高通量測序技術及生物信息學方法，對肝癌組織和肝硬化組織樣品進行轉錄組學分析。篩選到486 個差異基因，相對于肝硬化組織，肝癌組織有157 條基因表達上調，比如，基因SPINK1在肝癌組表達量為肝硬化組的3.02 倍（P＜0.05）。Lee等[7]研究發現，SPINK1 能在HCC 患者高表達，其研究認為SPINK1 對肝癌細胞起著生長因子的作用，有增加腫瘤轉移可能。相對于肝硬化組織，329 個基因表達下調，比如，基因CXCL14 在肝硬化組表達量為肝癌組2.46 倍（P＜0.05）。Lin 等[8]發現，CXCL14 在肝癌組織，以及頭頸部鱗狀細胞癌和宮頸鱗狀細胞癌是一種明顯低表達的基因?；騀CN3 在肝硬化組表達量為肝癌組的2.35 倍（P＜0.05）。研究顯示，FCN3在HCC 中可作為腫瘤的潛在生物標志物[9-10]。本研究通過對差異表達顯著的基因進行功能富集分析，發現在肝硬化惡化為肝癌的過程中，“細胞周期”“有絲分裂”等生物過程受到影響。這也暗示這些顯著功能節點中包含的基因很可能與肝癌的發生發展相關。多項研究表明，各種細胞周期蛋白的異常激活導致不受機體控制的增殖是惡性腫瘤的特性之一[11-12]。王秀麗[13]研究發現，肝癌組織中細胞周期素依賴性激酶CDK1、CDK4 及細胞周期依賴性激酶抑制物CDKN2C 等持續高表達，導致細胞周期調控紊亂、細胞的惡性生長。為了進一步研究差異表達基因主要參與的代謝途徑和信號通路，我們進行了KEGG 信號通路富集分析，并且發現差異表達基因主要集中在視黃醇代謝、化學致癌作用、藥物代謝-細胞色素P450、細胞周期、p53 信號通路、細胞色素P450 對外源物質的代謝等16 個信號通路上。研究表明，非環狀類視黃醇是一種合成的視黃醇類代謝物，能夠抑制Ras/MAP 激酶信號轉導，進而降低視黃酸受體磷酸化水平而阻止肝癌的進展[14]。細胞色素P450 主要存在于細胞的內質網和線粒體內膜上，在許多器官和組織中都有表達，但在肝臟中含量最為豐富[15]，CYP1A2 是人體肝臟組織中主要的CYP 之一，Wuensch 等[16]發現，CYP1A2 在肝癌組織低表達，這與本研究結果一致。同時也有最新研究表明，在丙型病毒性肝炎相關肝癌中CYP1A2 已經可以作為判斷患者早期術后復發的獨立預測因子[17]。

本研究從整體上揭示差異基因的功能、代謝途徑和信號通路，為研究肝癌的發病提供新的證據和研究思路。近年來，隨著分子生物學、基因芯片和測序技術的發展，高通量數據海量增加，與肝癌生長、蔓延、轉移有關的基因和蛋白也越來越受到關注。目前研究也取得巨大進展，這些成果對肝癌的早期診斷、藥物選擇、預后判斷提供很大幫助，但由于肝癌相關的分子機制錯綜復雜，有許多研究尚處于實驗階段。因此，對肝癌分子機制的研究還有廣泛的前景。