法舒地爾對慢性不可預見性溫和應激所致大鼠抑郁樣行為和海馬區神經形態學的影響

劉 芳，劉偉存，彭延波

1.唐山市豐潤區人民醫院,河北064000；2.唐山工人醫院；3.華北理工大學附屬醫院

抑郁癥作為一種情感障礙類精神疾病，生理、心理、社會環境等多種因素均可誘發，發病率逐年增高，治愈率低，復發率高，病人多伴有自殺傾向。據報道，全球范圍內抑郁癥發病率約為3%，其中30%病人出現過自殺行為，約10%的病人自殺身亡[1-2]。研究發現，海馬結構的異常和病變嚴重影響了抑郁癥的發展進程。臨床觀察顯示，同正常人比較，抑郁癥病人的海馬體積較小，并且神經元細胞出現萎縮、丟失；除此之外，在動物模型中發現海馬神經元出現變性、凋亡和壞死的情況。因此，海馬區神經元的異常可能是抑郁癥形成、發展的重要病理學基礎。海馬在神經系統的可塑性、學習/記憶以及情感等高級認知功能中發揮重要作用。法舒地爾是一種Rho 激酶（Rho kinase,ROCK）抑制劑，主要應用于臨床研究。其主要作用有擴張血管，抑制炎細胞的浸潤和炎性介質的釋放，促進一氧化氮的形成，抑制纖維化形成，改善組織重構[3-5]。近年來臨床研究發現，銀杏酮酯和法舒地爾聯合應用，能夠有效緩解腦卒中后焦慮、抑郁障礙[6]。動物實驗也顯示，法舒地爾能夠有效抑制慢性束縛應激導致的抑郁樣行為，避免大鼠海馬神經元細胞樹突的減少。因此，本研究擬通過慢性不可預見性溫和應激（chronic unexpected mild stress，CUMS）法構建大鼠抑郁模型，觀察其抑郁樣行為的表現和海馬區神經組織學改變，并予以法舒地爾預處理，以研究海馬神經組織學改變與抑郁樣行為的關系和法舒地爾拮抗抑郁的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥物與主要儀器 5 周齡大鼠購于北京華阜康生物科技有限公司（SCXK 京2009?0004）的SPF 級雌性SD 大鼠30 只，體重140～160 g；規格為2 mL/30 mg 的鹽酸法舒地爾注射液（天津紅日藥業股份有限公司）；曠場反應箱和數據自動采集及處理系統（安來軟件科技有限公司）；Morris 水迷宮及視頻分析系統，購自北京智鼠多寶生物科技有限責任公司。鹽酸法舒地爾注射液（規格：2 mL，每支30 mg，天津紅日藥業股份有限公司）；曠場反應箱和數據自動采集及處理系統為安來軟件科技有限公司產品；Morris 水迷宮及視頻分析系統，購自北京智鼠多寶生物科技有限責任公司。

1.2 CUMS 動物模型制備 5 周齡雌性SD 大鼠30 只適應性飼養1 周，隨機分為CUMS 模型組、法舒地爾干預組和對照組，每組10 只。CUMS 模型組：每天接受以下11 種應激中的1 種刺激：潮濕墊料24 h；行為束縛24 h；鼠籠45°傾斜放置24 h；禁水或禁食24 h；4 ℃冰水或42 ℃熱水游泳5 min；電擊雙耳（0.8 mA）2 次，每次5 s；夾鼠尾持續1 min；晃動鼠籠持續15 min；照明持續24 h。同種刺激不連續出現，共計2 輪22 d；并在CUMS 前4 d 開始，腹腔注射生理鹽水0.2 mL/d，至實驗結束（第22 天）。法舒地爾干預組：在CUMS 前4 d開始，每天腹腔注射法舒地爾0.2 mL（30 mg/kg），持續至實驗結束（第22 天）。對照組：每天抓取1 次處理，在CUMS 前4 d 開始，腹腔注射生理鹽水0.2 mL/d，至實驗結束（第22 天）。

1.3 效果觀察

1.3.1 糖水偏好實驗 各組大鼠實行禁食和禁水24 h，所有大鼠均單獨飼養，每籠放置同樣的飲水瓶2 個，一個瓶中盛濃度為1%蔗糖水，另一個盛純凈水，每瓶200 mL，檢測1 h 內糖水/純凈水消耗。

1.3.2 曠場試驗 曠場試驗分析系統主要是通過觀察實驗動物在新異環境中的自主行為，進而探究動物的行為與緊張度。所有大鼠均先安置在曠場中心部位，以便進一步觀察記錄大鼠的行進距離（m）、中央格活動時間（s）、站立次數和修飾行為（次數）。

1.3.3 Morris 水迷宮實驗 Morris 水迷宮是一個規格為170 cm×50 cm 的圓形水池，其壁內為黑色，內設直徑12 cm，高29 cm 的安全島，圓形水池周圍環繞2 m的遮光布簾。每次實驗前大鼠適應環境2 h，將安全島加水至線上10 cm，并隨機放置于水迷宮中4 個象限中的任何一個，溫度控制在22～25 ℃。每日固定時間、每只大鼠從不同象限進行游泳訓練，120 s 內沒有找到安全島，將其放在平臺上停留10 s，然后進行下次訓練，連續訓練4 d，以大鼠均能夠在大致相同時間內找到安全島視為訓練成功。在造模前后連續測試3 d，每天測試6 次，記錄其下水后找到平臺的時間（s），即逃避潛伏期，取3 d 的測試成績作為其空間記憶成績。并記錄大鼠在水迷宮中行走總路程。

1.3.4 海馬區神經組織形態學檢測 實驗結束，通過腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，剪開腹部，暴露心臟。通過將加滿生理鹽水的灌注針自左心室插入主動脈，同時剪開右心耳，進行左心體循環灌注，在灌注150 mL生理鹽水的基礎上，再向其中灌注4%多聚甲醛150 mL進行內固定。冠狀面取材，將小腦切下，自視交叉后間隔1 mm 連續取材，固定于4%多聚甲醛中。常規石蠟包埋，8 μm 連續切片。HE 染色，中性樹膠封片，光鏡觀察海馬組織形態學變化。

1.4 統計學分析 采用SPSS 13.0 統計分析軟件進行統計學分析，定量資料以均數±標準差（±s）表示。3 組間采用單因素方差分析，LSD 檢驗進行兩兩比較，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 法舒地爾對CUMS 大鼠糖水偏好行為的影響 CUMS 后，CUMS 模型組大鼠的糖水消耗量、糖水偏好率均低于對照組（P＜0.05），而法舒地爾干預組大鼠的糖水消耗量、糖水偏好率均高于CUMS 模型組（P＜0.05），見表1。

表1 CUMS 應激前后3 組大鼠純凈水消耗量、糖水消耗量、糖水偏好率比較

2.2 法舒地爾對CUMS 大鼠曠場試驗行為的影響 CUMS 前，對3 組大鼠進行曠場試驗基線水平測定，各組大鼠在行進距離、中央格活動時間、站立次數和修飾行為比較差異均無統計學意義，CUMS 后，CUMS 組大鼠的行進距離、中央格活動時間、站立次數、修飾行為均低于對照組（P＜0.05），法舒地爾干預組大鼠的行進距離、中央格活動時間、站立次數、修飾行為均高于CUMS 組（P＜0.05）。見表2。

表2 CUMS 前后大鼠曠場試驗結果

2.3 法舒地爾對CUMS 大鼠水迷宮行為的影響 水迷宮結果顯示，CUMS 前3 組逃避潛伏期比較差異無統計學意義（P＞0.05）。CUMS 后，CUMS 模型組大鼠的逃避潛伏期較對照組延長（P＜0.05），而法舒地爾干預組的逃避潛伏期較CUMS 模型組縮短（P＜0.05），與對照組接近。見表3。圖1 示法舒地爾對大鼠水迷宮中行走總路程的影響，與對照組比較，CUMS模型組大鼠的平均行走總路程明顯延長（P＜0.05），而法舒地爾干預組大鼠的平均行走總路程與對照組相似，較CUMS 模型組明顯縮短（P＜0.05）。

表3 法舒地爾對CUMS 大鼠水迷宮逃避潛伏期的影響 單位：s

2.4 法舒地爾對CUMS 模型海馬區神經形態學的影響 如圖2 所示，對照組海馬區域細胞排列整齊，密度較大，錐體細胞層數較多，胞體豐滿含較多突起。CUMS 組細胞排列不齊、疏松，錐體細胞層數變少，細胞收縮，突起減少。法舒地爾干預組海馬區域神經細胞較CUMS 組有所改善。

圖1 法舒地爾對大鼠水迷宮中行走總路程的影響

圖2 大鼠海馬區神經形態學變化（HE 染色）

3 討論

大鼠抑郁模型的造模方法主要包括環境刺激（CUMS、懸尾試驗、強迫游泳等）、社會刺激（母仔分離、孤養模型）、藥物誘導（地塞米松、糖皮質激素、利血平、精神興奮劑戒斷模型、育亨賓、5-羥色胺酸和苯丙胺等）、手術制備（嗅球切除、脊髓橫斷、腦卒中后抑郁模型）、產后抑郁模型等。其中藥物誘導、手術制備、產后抑郁屬于有明顯的誘導因素，其抑郁形成機制較為簡單，適合進行抗抑郁藥物的篩選，或屬于特定的抑郁模型。然而，抑郁與應激關系密切，CUMS 因能夠模仿人類抑郁行為而被廣泛應用。模型中的應激因子多具有不可預見性和多變性，同時沒有一種應激條件是抑郁行為的決定因素，在刺激因素、發生機制和抑郁樣表現方面，與人類實際生活中的長期低水平慢性應激事件較為相符[7-9]。本研究采用了CUMS 大鼠抑郁模型，結果顯示，采用CUMS 的20 只大鼠無死亡，經糖水消耗實驗、曠場試驗和水迷宮實驗表明，均伴有不同程度的抑郁樣行為，證明大鼠造模成功。本研究觀察到，CUMS 模型組大鼠糖水消耗量顯著減少，提示對獎賞反應性下降，快感缺失；曠場試驗中CUMS 大鼠的行進距離、中央格活動時間、站立次數和修飾行為均較對照組明顯減少，這些低探索行為反映了大鼠的抑郁情緒[10-13]。海 馬 結 構 包 括 海 馬 回（CA1、CA2、CA3 和CA4，主要由錐體神經元）、齒狀回（顆粒神經元）、腦小角等部位組成，位于內側額葉的皮質表層底部，是大腦邊緣系統的重要組成部分，在神經系統的可塑性、學習/記憶以及情感等高級認知功能方面起到了關鍵的調節作用。臨床研究顯示，抑郁病人的杏仁核、海馬體積較正常人小，同時病程與海馬體積呈負相關[14]。重度抑郁癥病人海馬齒狀回神經元細胞、神經膠質數目減少，增殖性指標Ki-67 陽性數目減少，提示伴有神經細胞的增殖受限[15]。提示抑郁癥發生與海馬神經細胞的結構受損、數目減少、再生障礙關系密切。本研究結果表明，CUMS 模型組大鼠逃避潛伏期延長，學習記憶能力下降，提示可能與海馬結構異常有關。本研究結果也顯示，對照組海馬區域細胞排列整齊，密度較大，錐體細胞層數較多，胞體豐滿含較多突起。而CUMS 模型組細胞排列不齊、疏松，錐體細胞層數變少，細胞收縮，突起減少。說明CUMS 所導致的海馬神經結構異常可能是其抑郁樣行為的重要病理學基礎之一。

4 小結

CUMS 大鼠出現抑郁樣行為，表現在糖水消耗量減少,行進距離、中央格活動時間、站立次數和修飾行為均較對照組明顯減少，逃避潛伏期延長，學習記憶能力下降。CUMS 大鼠海馬區細胞發生病理改變，給予CUMS 大鼠法舒地爾處理，能夠改善海馬區細胞發生病理改變，減輕CUMS 大鼠的抑郁樣行為。