補骨脂素對絕經后大鼠骨質疏松及PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響

陳露華 唐宏宇

摘 要 目的：研究補骨脂素對絕經后大鼠骨質疏松及磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路的影響。方法：將60只健康雌性SD大鼠隨機分為正常組、模型組、陽性對照組（0.09 mg/kg雌二醇）和補骨脂素低、中、高劑量組（22、44、88 mg/kg），每組10只。除正常組外，其余各組大鼠均采用卵巢摘除去勢法建立絕經后骨質疏松模型。術后正常飼養2個月，正常組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，各藥物組大鼠灌胃相應藥液;灌胃體積均為0.005 mL/g，每天1次，連續98天。末次給藥24 h后，測定大鼠右側下肢股骨和椎骨的骨密度，血清中鈣離子、骨鈣素、Ⅰ型前膠原N端前肽（P1NP）含量和骨形態發生蛋白2（BMP2）、血管內皮生長因子（VEGF）水平，以及股骨組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA及蛋白的表達水平。結果：與正常組比較，模型組大鼠股骨和椎骨的骨密度以及血清中鈣離子、骨鈣素、P1NP含量和BMP2、VEGF水平均顯著降低，PI3K、Akt、mTOR mRNA及蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，補骨脂素中、高劑量組和陽性對照組大鼠股骨和椎骨的骨密度以及血清中鈣離子、骨鈣素、P1NP含量和BMP2（補骨脂素中劑量組除外）、VEGF（補骨脂素中劑量組除外）水平均顯著升高，各藥物組PI3K、Akt、mTOR mRNA（補骨脂素低劑量組除外）及蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且高劑量組股骨骨密度和鈣離子、BMP2水平以及PI3K蛋白表達水平均顯著高于陽性對照組（P<0.05），mTOR mRNA表達水平顯著低于陽性對照組（P<0.05）。結論：補骨脂素可改善絕經后大鼠的骨質疏松，其機制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路有關。

關鍵詞 補骨脂素;絕經后骨質疏松癥;磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路;大鼠

中圖分類號 R683;R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）06-0697-05

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effect of psoralen on osteoporosis in postmenopausal rats and PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. METHODS： Totally 60 healthy female SD rats were randomly divided into normal group， model group， positive control group （0.09 mg/kg estradiol）， psoralen low-dose， medium-dose and high-dose groups （22， 44， 88 mg/kg）， with 10 rats in each group. Except for normal group， the other groups were ovariectomized to establish Postmenopausal osteoporosis model. After 2 months of normal feeding after operation， normal group and model group were given the constant volume of normal saline intragastrically， and administration groups were given the corresponding solution intragastrically; the volume was 0.005 mL/g， once a day， for consecutive 98 days. 24 h after last administration， the BMD of femur and vertebra of right lower extremities in rats was determined. The contents of serum calcium， osteocalcin and P1NP， the serum levels of BMP2 and VEGF were determined; mRNA and protein expression of PI3K， Akt and mTOR in femur tissue were detected.RESULTS： Compared with normal group， BMD of femur and vertebra， serum contents of calcium， osteocalcin， P1NP and serum levels of BMP2， VEGF in model group were decreased significantly， while the mRNA and protein expression of PI3K， Akt and mTOR were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， BMD of femur and vertebra， serum levels of calcium， osteocalcin， P1NP and serum levels of BMP2 （except for psoralen medium-dose group）， VEGF （except for psoralen medium-dose group） were increased significantly in psoralen medium-dose and high-dose groups， positive control group， while the mRNA expression （except for psoralen low-dose group） and protein expression of PI3K， Akt and mTOR in administration groups were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）; BMD of femur， serum levels of calcium， BMP2 and PI3K protein expression in psoralen high-dose group were significantly higher than positive control group （P<0.05）， and mTOR mRNA expression in psoralen high-dose group was significantly lower than positive control group （P<0.05）. CONCLUSIONS： Psoralen can improve osteoporosis in postmenopausal rats， the mechanism of which may be associated with inhibiting PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.

KEYWORDS? ?Psoralen; Postmenopausal osteoporosis; PI3K/Akt/mTOR signaling pathway; Rat

絕經后骨質疏松癥（Postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一種常發生于絕經后5～10年且以高度脆性和結構破壞為特征的代謝性骨病[1]。PMOP的發生常歸因于絕經后的雌激素缺乏，由于雌激素對破骨細胞的抑制作用減弱，骨吸收功能強于骨形成，造成骨重建失衡，從而導致骨強度下降[2]。據估計，30%～50%的絕經后婦女患有這種疾病，且隨著人口老齡化加劇，PMOP的衛生經濟負擔成倍增加，已成為一個重要的公共衛生問題[3-4]。近年來發現，自噬與PMOP的發生發展密切相關：自噬是細胞通過溶酶體將受損的細胞器、錯誤折疊的蛋白質及其他大分子物質等降解并再利用的自我保護機制，可通過減輕氧化應激所致的細胞損傷來延緩、減輕骨量的丟失[5-6]。中藥補骨脂具有補腎助陽壯骨等功效，其有效成分補骨脂素近年來多被臨床報道用于治療骨質疏松癥[7]。研究發現，激活的磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路可促進細胞存活、生長和增殖，與雌激素通路有多處相交且有相互促進的作用，共同影響骨代謝[8]。基于此，本文研究了補骨脂素對絕經后大鼠骨質疏松及PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響，旨在為闡明其抗骨質疏松作用機制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Ⅸ81型透射電子顯微鏡（德國Leica公司）、3K15型低溫高速離心機（美國Sigma公司）、ABI 7500型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國ABI公司）、AX-Ⅱ型凝膠成像儀（美國Life Technology公司）、Dexa Pro-1型雙能X射線骨密度儀（美國GE公司）和680型全自動酶標儀、PowerPac Basic型電泳儀、BT25S型天平（美國Bio-Rad公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

補骨脂素原料藥（批號1202133231，純度98%）購自廣東晶欣生物科技有限公司，戊酸雌二醇片（陽性對照，批號20198876，規格2 mg/片）購自廊坊高博京邦制藥有限公司，10%水合氯醛（批號20191204）購自天津市大茂化學試劑廠，青霉素注射液（批號2019153651253，規格160萬單位/支）購自河南省中農康畜貿易有限公司，血清鈣離子、骨鈣素、Ⅰ型前膠原N端前肽（P1NP）、骨形態發生蛋白2（BMP2）、血管內皮生長因子（VEGF）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒、Trizol試劑、RIPA蛋白裂解液（批號ZN2798450、ZN27841224、ZN27629852、ZN27637841、ZN25725730、ZN13613654、ZN45845518）均購自美國Invitrogen公司，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒、PCR試劑盒、BCA蛋白含量檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、ECL試劑盒（批號HGEB45416、HGEB45518、HGEB48760、HGEB76375、HGEB98421）均購自美國Sigma公司，山羊抗大鼠PI3K、Akt、mTOR多克隆抗體（一抗）和辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗大鼠免疫球蛋白G（IgG）抗體（二抗）、逆轉錄試劑盒（批號GGSKCqwes7758、GGSKCqwes8932、GGSKCqwes5524、GGSKCqwe7643、GGSKCqwes7365）均購自廣州歐慕生物科技有限公司;其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為蒸餾水。

1.3 動物

SPF級成年SD大鼠60只，雌性，體質量200～280 g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號為SCXK（粵）2019-0047。本研究方案通過廣州中醫藥大學動物實驗中心倫理委員會批準。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

所有大鼠適用性喂養2周后，隨機分為正常組、模型組、陽性對照組（0.09 mg/kg雌二醇[9]）和補骨脂素低、中、高劑量組（22、44、88 mg/kg，給藥劑量根據前期預實驗結果設置），每組10只。除正常組外，其余各組大鼠均采用卵巢摘除去勢法建立PMOP模型[10]。首先將大鼠麻醉（腹腔注射10%水合氯醛溶液），然后在其第4腰椎橫突0.5 cm左右處縱深剖離約1.2 cm，切除雙側卵巢，同時腹腔注射青霉素（每天10萬單位，每天1次，連續3天）以預防感染。術后大鼠正常飼養2個月，正常組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，各藥物組大鼠灌胃相應藥液（均以生理鹽水為溶劑），灌胃體積均為0.005 mL/g，每天1次，連續給藥98天。

2.2 大鼠股骨、椎骨骨密度的檢測

末次給藥24 h后，各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，將其右股骨、椎骨部位放在雙能X射線骨密度儀上檢測股骨、椎骨骨密度。

2.3 大鼠血清中鈣離子、骨鈣素、P1NP含量和BMP2、VEGF水平的檢測

采用ELISA法進行檢測。末次給藥2 h后，于大鼠腹主動脈取血3 mL，放置1.5 h后，以4 000 r/min離心12 min，分離上層血清，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，使用酶標儀檢測血清中鈣離子、骨鈣素、P1NP含量和BMP2、VEGF水平。

2.4 大鼠股骨組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA表達的檢測

采用實時熒光定量PCR法進行檢測。大鼠取血后處死，取其左側股骨洗凈，取部分骨片，采用Trizol法提取總RNA，按試劑盒說明書方法操作，將總RNA逆轉錄合成cDNA，行PCR擴增。反應體系（共20 ?L）包括cDNA模板4 μL，上、下游引物各2 μL，SYBR熒光染料10 μL，無核酸酶水2 μL。反應條件為94 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min（共40個循環）。以GAPDH為內參，生成擴增曲線和熔解曲線，使用Image J v1.5.1軟件分析并采用2-ΔΔCt法計算PI3K、Akt、mTOR mRNA的表達水平。PI3K、Akt、mTOR的引物序列及產物長度見表1。

2.5 大鼠股骨組織中PI3K、Akt、mTOR蛋白表達的檢測

采用Western blot法進行檢測。取大鼠股骨組織適量，研磨后，用RIPA蛋白裂解液進行裂解，以12 000? ? ? r/min離心12 min，取上清液，使用BCA蛋白含量檢測試劑盒測定蛋白濃度。取蛋白，煮沸10 min變性;取變性后的蛋白適量，行SDS-PAGE后轉膜，封閉2 h，洗膜5 min，分別加入山羊抗大鼠PI3K、Akt、mTOR一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），于4 ℃下孵育過夜;洗膜5 min，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 200），室溫孵育1 h;以ECL顯色，置于凝膠成像儀上成像并采用Image J v1.5.1軟件處理分析，以目標蛋白與內參（GAPDH）蛋白條帶的灰度值比值作為目標蛋白的表達水平。

2.6 統計學方法

采用SPSS 25.0軟件對數據進行統計分析。符合正態分布的計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 補骨脂素對PMOP模型大鼠股骨、椎骨骨密度的影響

與正常組比較，模型組大鼠股骨、椎骨骨密度均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，補骨脂素中、高劑量組和陽性對照組大鼠股骨、椎骨骨密度均顯著升高（P<0.01）。與補骨脂素低劑量組比較，補骨脂素高劑量組和陽性對照組大鼠股骨、椎骨骨密度均顯著升高（P<0.01）。與陽性對照組比較，補骨脂素高劑量組大鼠股骨骨密度顯著升高（P<0.05），而椎骨骨密度差異無統計學意義（P>0.05）。補骨脂素對PMOP模型大鼠股骨、椎骨骨密度的影響見表2。

3.2 補骨脂素對PMOP模型大鼠血清中鈣離子、骨鈣素、P1NP含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中鈣離子、骨鈣素、P1NP含量均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，補骨脂素中、高劑量組和陽性對照組大鼠血清中鈣離子、骨鈣素、P1NP含量均顯著升高（P<0.05）。與補骨脂素低劑量組比較，補骨脂素高劑量組和陽性對照組大鼠血清中鈣離子、骨鈣素、P1NP含量均顯著升高（P<0.05）。與陽性對照組比較，補骨脂素高劑量組大鼠血清中鈣離子含量顯著升高（P<0.05），而骨鈣素、P1NP含量差異均無統計學意義（P>0.05）。補骨脂素對PMOP模型大鼠血清中鈣離子、骨鈣素、P1NP含量的影響見表3。

3.3 補骨脂素對PMOP模型大鼠血清中BMP2和VEGF水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中BMP2和VEGF水平均顯著降低（P<0.01）。與模型組和補骨脂素低劑量組比較，補骨脂素高劑量組和陽性對照組大鼠血清中BMP2和VEGF水平均顯著升高（P<0.05）。與陽性對照組比較，補骨脂素高劑量組大鼠血清中BMP2水平顯著升高（P<0.05），而VEGF水平差異無統計學意義（P>0.05）。補骨脂素對PMOP模型大鼠血清中BMP2和VEGF水平的影響見表4。

3.4 補骨脂素對PMOP模型大鼠股骨組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠股骨組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA的表達水平均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，補骨脂素中、高劑量組和陽性對照組大鼠股骨組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA的表達水平均顯著降低（P<0.05）。與補骨脂素低劑量組比較，補骨脂素高劑量組和陽性對照組大鼠股骨組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA的表達水平均顯著降低（P<0.05）。與陽性對照組比較，補骨脂素高劑量組大鼠股骨組織中mTOR mRNA的表達水平顯著降低（P<0.05），而PI3K、Akt mRNA的表達水平差異均無統計學意義（P>0.05）。補骨脂素對PMOP模型大鼠股骨組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA表達的影響見表5。

3.5 補骨脂素對PMOP模型大鼠股骨組織中PI3K、Akt、mTOR蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠股骨組織中PI3K、Akt、mTOR蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，補骨脂素低、中、高劑量組和陽性對照組大鼠股骨組織中PI3K、Akt、mTOR蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.05）。與補骨脂素低劑量組比較，補骨脂素中、高劑量組和陽性對照組大鼠股骨組織中PI3K、Akt、mTOR蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.05）。與陽性對照組比較，補骨脂素高劑量組大鼠股骨組織中PI3K蛋白的表達水平顯著升高（P<0.05），而Akt、mTOR蛋白的表達水平差異均無統計學意義（P>0.05）。補骨脂素對PMOP模型大鼠股骨組織中PI3K、Akt、mTOR蛋白表達水平的影響見圖1、表6。

4 討論

目前，治療PMOP的化學藥主要包括雙膦酸鹽、降鈣素、選擇性雌激素受體調節劑（如戊酸雌二醇）、甲狀旁腺激素類似物等[11-12]。但這些藥物在臨床使用中均有可能引發不良反應（如高鈣血癥、高磷血癥）或造成其他風險[13]。近年來，中醫藥通過“多成分、多途徑、多靶點”的方式在PMOP的治療中發揮了越來越大的作用[14]。傳統中藥補骨脂具有補腎健骨的作用，研究發現補骨脂的有效成分補骨脂素作為一種天然植物雌激素，可改善骨質疏松模型小鼠骨代謝指標和股骨生物力學性能[15]，但其相關作用機制尚未闡明。

骨鈣素和P1NP是反映全身性骨代謝變化的骨轉換標志物，是反映成骨細胞功能狀態的直接或間接產物[16]。本研究結果表明，補骨脂素和戊酸雌二醇均可提高PMOP模型大鼠血清中骨鈣素和P1NP的含量，且與補骨脂素成劑量依賴性趨勢。

維持骨重建過程中，骨形成與骨吸收的動態平衡是治療PMOP的一個關鍵點[17]。已有研究發現，PI3K/Akt/mTOR信號通路可調控成骨細胞和破骨細胞的活動[18]。該通路是癌癥中的經典生長調節途徑，其中PI3K/Akt參與細胞增殖、遷移和存活等多種過程;mTOR是該PI3K/Akt途徑下游的關鍵激酶，并可通過多種方式被PI3K激活[19]。已有研究表明，骨組織中的BMP2等信號分子能夠選擇性激活PI3K/Akt途徑中的相關基因，從而調控成骨細胞和破骨細胞的活動[20-21]。抗骨質疏松藥物雷奈酸鍶可通過PI3K/Akt/mTOR信號通路促進成骨及血管生成[22];白藜蘆醇可通過PI3K/Akt/mTOR信號通路調節線粒體吞噬作用來保護地塞米松處理的成骨細胞，同時抑制破骨細胞[23]。以上均說明了PI3K/Akt/mTOR信號通路可影響骨形成與骨吸收。VEGF作為主要的血管形成因子之一，同時又是骨生長因子之一，在骨修復中也起著重要作用[24]。本研究結果表明，補骨脂素和戊酸雌二醇均可上調PMOP模型大鼠血清中BMP2、VEGF的水平，下調其股骨組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA及蛋白的表達水平，且與補骨脂素成劑量依賴性趨勢，補骨脂素高劑量組部分指標改善效果有優于戊酸雌二醇的趨勢。

綜上所述，補骨脂素可顯著提高PMOP模型大鼠的骨密度、骨鈣素等指標，改善絕經后大鼠的骨質疏松，其機制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路有關。

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（收稿日期：2020-11-10 修回日期：2021-02-22）

（編輯：鄒麗娟）