基于Nrf2通路探討曲克蘆丁對急性腦梗死大鼠神經功能的保護作用

辛 月，郭 偉

急性腦梗死(acute cerebral infarction, ACI)是目前臨床上極為常見的腦血管疾病，具有較高的致殘率和病死率，嚴重威脅著中老年人的健康[1]。隨著人們生活模式和飲食結構的轉變，ACI發病率逐年升高且呈年輕化趨勢，目前其發病率已超過腦血管疾病的75%[2]。曲克蘆丁是一種半合成的黃酮類化合物，對腦缺血損傷有顯著的保護作用及抗炎、抗過敏作用，但臨床上通常將曲克蘆丁與依達拉奉等藥物協同使用，因此曲克蘆丁的具體機制尚不清楚[3-4]。氧化應激是腦缺血再灌注損傷的主要環節，核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor， Nrf2)途徑是機體內最重要的抗氧化應激系統[5-6]。本研究通過“線栓法”制備ACI模型，基于Nrf2途徑探討曲克蘆丁對ACI大鼠神經功能的保護作用，旨在為臨床治療ACI提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料 曲克蘆丁片(山西亞寶藥業集團股份有限公司，國藥準字： h14022940)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗大鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2、Nrf2、血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)、醌氧化還原酶1(quinoneoxidoreductase 1, NQO1)、GAPDH抗體均由Abcam公司提供。

1.2實驗動物及分組 清潔級雄性8周齡SD大鼠30只，體重(160±20)g；購自華中科技大學動物實驗中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(鄂)2016-0009。30只大鼠隨機分為假手術組、模型組和干預組，每組10只。均適應性飼養1周。

1.3造模及用藥 模型組和干預組大鼠均參照文獻[7]中的方法制備ACI動物模型，具體操作：大鼠進行乙醚吸入麻醉后采取仰位固定，在頸部中位處切口，暴露頸總動脈、頸內動脈及頸外動脈，用浸過肝素的拴線由頸內動脈插入至大腦前動脈，進行結扎操作，完成后逐層進行縫合；持續2 h后，小心拆開縫合處，緩慢拔出拴線，恢復該處的血流灌注，再次縫合。假手術組大鼠進行手術，但不結扎。ACI模型制備完成后，干預組立刻給予曲克蘆丁片30 mg/kg灌胃，假手術組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，均連續用藥10 d。

1.4神經功能評分 根據參考文獻[8]中的方法，在末次給藥后對3組大鼠進行神經功能評分：將大鼠放到地上，出現向缺血對側轉圈情況，計1分。捏住大鼠尾巴提起后，出現缺血對側的肩內旋計3分，前肢肘屈曲計2分，腕屈曲計1分。對大鼠缺血對側推動時阻力減小，按照減小程度計1～3分；將大鼠放在金屬網上，根據缺血對側肌張力的下降程度計1～3分。

1.5曠野實驗 按照參考文獻[9]中的方法：測試前給予大鼠抓取刺激，之后立刻讓大鼠進入敞箱中進行活動性測試(保證測試周圍環境安靜)。每只大鼠測定1次，每次3 min，根據大鼠穿越底面塊數為水平活動得分，以直立次數為垂直得分。每只大鼠測定后清潔敞箱，避免對下一個大鼠的實驗結果造成影響。

1.6蘇木精-伊紅(HE)染色 3組大鼠進行麻醉后斷頭取腦，去除腦組織中的嗅球、小腦和低位腦干后，在4%多聚甲醛溶液中固定3 d，進行石蠟制片后行常規HE染色，利用倒置光學顯微鏡觀察腦組織的神經元形態結構。

1.7腦組織中SOD、MDA、LDH、iNOS含量測定 3組大鼠進行麻醉后斷頭處理，剝取無海馬組織的腦組織，研磨之后制成勻漿，經過15 min的低溫離心后得到上清液，嚴格按照相關試劑盒步驟處理后，用紫外-可見分光光度計測量SOD的活性、MDA、LDH、iNOS的含量。

1.8Western blot檢測腦組織中Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Bcl-2、Bax、Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平 3組大鼠進行麻醉后斷頭處理后，剝取腦組織50～100 μg，勻漿器中采用無菌剪刀剪碎，進行BCA蛋白定量、高溫蛋白變性，電泳，等到溴酚藍快到膠底部的時候停止，然后進行轉膜、春紅溶液染色，在室溫條件下用5%脫脂奶粉進行2 h的封閉處理，對應一抗、GAPDH(1∶1000)4℃過夜；洗膜，二抗(1∶100)在37℃條件下恒溫孵育1 h后電致化學發光(ECL)顯色。由Quantity-one軟件分析Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、Nrf2、HO-1、NQO1蛋白條帶。

2 結果

2.1大鼠一般情況 假手術組大鼠飲食正常，活動規律。模型組大鼠活動少，部分大鼠出現躁動、喂養困難及體重增長緩慢的情況。干預組大鼠精神狀態得到改善，飲食量也明顯增加。實驗過程中3組均未出現大鼠死亡情況。

2.2神經功能評分及曠野實驗結果比較 模型組大鼠神經功能評分高于假手術組，曠野實驗的水平得分和垂直得分均低于假手術組，差異均有統計學意義(P<0.01)。干預組大鼠神經功能評分低于模型組，曠野實驗的水平得分和垂直得分均高于模型組，差異均有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 3組大鼠的神經功能評分及曠野實驗結果比較分)

2.3大鼠腦組織病理改變 假手術組大鼠海馬區神經元染色均勻，層次分明，結構完整排列致密規則。模型組大鼠海馬區神經元細胞層次紊亂，染色不勻，排列疏松，伴隨有細胞碎片及空泡改變。干預組大鼠海馬區神經元細胞空泡樣改變及神經元損傷性病理變化較模型組減輕。見圖1。

圖1 3組大鼠腦組織海馬神經元病理變化情況(HE×400)模型組為ACI模型，干預組給予曲克蘆丁片；ACI為急性腦梗死

2.4大鼠腦組織SOD、MDA、LDH、iNOS含量比較 模型組大鼠腦組織中MDA、LDH、iNOS含量高于假手術組，SOD含量低于假手術組，差異均有統計學意義(P<0.01)。干預組大鼠腦組織中MDA、LDH、iNOS含量低于模型組，SOD含量高于模型組，差異均有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 3組大鼠腦組織SOD、MDA、LDH、iNOS含量比較

2.5大鼠腦組織Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達量比較 模型組大鼠腦組織中Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Bax蛋白表達量高于假手術組，Bcl-2蛋白表達量低于假手術組，差異均有統計學意義(P<0.01)。干預組大鼠腦組織中Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Bax蛋白表達量低于模型組，Bcl-2蛋白表達量高于模型組，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖2、表3。

表3 3組大鼠腦組織中Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達量比較

圖2 3組大鼠腦組織中Cleaved-Caspase-3、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達情況模型組為ACI模型，干預組給予曲克蘆丁片；ACI為急性腦梗死

2.6腦組織Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達量比較 模型組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達量低于假手術組，差異有統計學意義(P<0.01)。干預組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達量高于模型組，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3、表4。

表4 3組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達量比較

3 討論

ACI發生后會增加腦組織血管通透性，使得血管內的氧自由基、鈣離子及興奮性氨基酸水平升高；同時腦細胞代謝障礙又會導致炎性細胞因子合成，破壞血管壁加重腦組織缺血癥狀[10]。目前ACI治療的核心在于恢復缺血區域血流灌注，緩解缺血癥狀；但腦缺血后再灌注損傷是治療后常見的并發癥，會引起更為強烈的氧化應激以及炎癥反應[11]。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組神經功能評分明顯升高，曠野實驗水平得分及垂直得分明顯降低，并且腦組織HE染色也顯示神經元結構損傷嚴重；干預組神經功能評分顯著降低，曠野實驗水平得分及垂直得分明顯升高，并且腦組織神經元結構損傷也得到了明顯的修復。表明曲克蘆丁具有保護神經功能的作用。曾靜等[12]研究發現，曲克蘆丁具有保護神經血管單元結構的作用，可能是通過抑制iNOS和基質金屬蛋白酶-9的表達，減少3-硝基酪氨酸的產生來實現。但缺血性損傷以及缺血再灌注損傷都會引起機體的氧化應激反應；而Nrf2途徑作為機體抵抗內外界氧化及刺激的防御性信號轉導通路，其內源性抗氧化應答機制在氧化應激過程中發揮著重要的作用[13]。因此本研究基于Nrf2通路來探究曲克蘆丁對ACI大鼠神經功能的保護作用。

腦缺血及再灌注損傷會導致體內產生大量活性氧(ROS)，SOD、過氧化氫酶等抗氧化酶中和ROS的速度及活性受限，引起ROS失衡；沒還原掉的ROS會對細胞膜造成嚴重的氧化破壞，MDA就是該過程的終產物之一[14]。LDH對于腦組織損傷最為敏感，因此其水平升高常用于反映腦組織損傷程度[15]。同時iNOS也會被這些刺激激活，持續產生大量的一氧化氮，造成毒害作用[16]。Nrf2是一種重要的抗過氧化反應的蛋白，當機體產生氧化應激反應時，Nrf2能夠迅速地磷酸化激活并轉移至細胞核中，通過作用下游ARE蛋白，從而促進HO-1、SOD1、NQO1等抗氧化蛋白表達，對細胞和器官起到保護作用[17]。本研究結果顯示，模型組腦組織中MDA、LDH、iNOS含量顯著升高，而SOD含量及Nrf2、HO-1、NQO1表達水平顯著降低。干預組MDA、LDH、iNOS含量降低，而SOD含量、Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達明顯升高。表明曲克蘆丁能夠誘導Nrf2通路激活，誘導下游抗氧化蛋白合成，增強ROS的還原能力，緩解腦組織中過量ROS引起的氧化應激損傷。

神經元細胞的凋亡是神經損傷最直接的影響因素，本研究通過對腦組織中凋亡途徑相關蛋白的表達水平分析發現，曲克蘆丁能夠明顯抑制“死亡執行蛋白酶”Caspase-3的表達[18]，同時還能夠抑制Bax/Bcl-2比值。Bax/Bcl-2是調控細胞凋亡過程且功能相互對立的基因，也是調控線粒體凋亡途徑的關鍵蛋白[19]，說明曲克蘆丁可能激活Nrf2信號通路，促進體內SOD、HO-1、NQO1等抗氧化酶的合成分泌，增強ROS的還原能力，減輕ROS對線粒體膜氧化損傷，并減少一氧化氮對細胞的毒性作用，抑制神經元細胞凋亡從而發揮神經保護功能。

綜上所述，曲克蘆丁可能通過促進Nrf2/HO-1/NQO1通路緩解大鼠ACI后的氧化損傷，抑制神經元細胞凋亡，保護神經功能。本研究初步揭示了曲克蘆丁作用于ACI氧化應激的可能調控機制，但ACI引起的腦損傷因素較多，曲克蘆丁還可能在其他途徑發揮保護神經功能的作用，有待進一步研究。