黃瓜CsGPX基因克隆與細菌性角斑病脅迫下的表達分析

孟令波 孫婷婷 趙倩 胡寶忠

摘要 [目的]克隆CsGPX基因并研究其與黃瓜抗病性的關系。[方法]采用RT-PCR技術克隆黃瓜CsGPX基因cDNA序列全長，并對其進行生物信息學分析;采用熒光定量PCR的方法分析CsGPX基因在細菌性角斑病侵染0～96h下的表達情況。[結果]CsGPX基因cDNA序列全長914bp，包含一個513bp的開放閱讀框，編碼170個氨基酸，該基因編碼蛋白的相對分子質量約為19.02kD，理論等電點是8.66，為親水性蛋白，不具有跨膜結構，不含信號肽序列。實時熒光定量PCR分析表明，CsGPX在黃瓜葉中有表達。在黃瓜細菌性角斑病菌侵染下，該基因在黃瓜葉中表達增高，明顯受黃瓜細菌性角斑病菌的誘導。[結論]CsGPX基因的分子鑒定為進一步解析該基因在黃瓜抗病機制方面的作用提供重要依據。

關鍵詞 黃瓜;谷胱甘肽過氧化物酶;基因克隆;細菌性角斑病;熒光定量PCR

中圖分類號 S.436.421文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2021）07-0099-04

Abstract[Objective]TocloneCsGPXgeneandstudytherelationshipbetweenCsGPXgeneanddiseaseresistanceofcucumber.[Method]TheCsGPXgenecDNAfulllengthsequencewasclonedbyRT-PCRtechnology.CharacteristicsincludingthephysicochemicalpropertiesandconserveddomainofthededucedCsGPXproteinweredeterminedbyaseriesofbioinformaticstools.qRT-PCRtechnologywasperformedtomeasurethetranscriptlevelsofCsGPXgeneinducedbyP.syringaepv.Lachrymans.[Result]ThefulllengthnucleotidesequenceofCsGPXwas914bp，containingacompleteopenreadingframeof513bpwhichencodedapolypeptideof170aminoacids.Bioinformaticsanalysisoftheaminoacidsequenceshowedthatthemolecularweightofencodedproteinwas19.02kD，andtheoreticalisoelectricpointwas8.66.Thisproteinwasahydrophilicprotein，withouttransmembraneandsignalpeptidesequence.TheexpressionanalysesofthegenebyqRT-PCRshowedthattheCsGPXexpressdinCucumberleaves.InducedbyP.syringaepv.Lachrymans，thetranscriptlevelsofCsGPXincucumberleavesremarkablyincreasedwiththeextensionofinductiontime.[Conclusion]ThisstudylaidafoundationforprovidingimportantbasisforCsGPXgeneondiseaseresistancemechanismofcucumber.

KeywordsCucumber;Glutathioneperoxidase;Genecloning;Pseudomonassyringaepv.Lachrymans;RealtimefluorescencequantitativePCR

作者簡介 孟令波（1970—），男，黑龍江哈爾濱人，副教授，博士，從事蔬菜遺傳育種與土壤微生物研究。*通信作者，教授，博士，從事植物學和植物分子生物學研究。

植物是好氧的生物體，在呼吸和光合作用過程中，線粒體、葉綠體和過氧化物酶體均可導致活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）的產生，尤其在外界環境脅迫下，活性氧含量大大增加[1]。為了避免ROS過量積累所造成的損傷，植物細胞內的防御系統（包括酶促和非酶促解毒系統）發揮了重要的作用。其中，酶促系統主要包括過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、抗壞血酸過氧化物酶和谷胱甘肽過氧化物酶等[2-3]。其中，谷胱甘肽過氧化物酶（glutathioneperoxidase，GPX）是機體內清除活性氧自由基的主要酶類，起到保護細胞免受氧化脅迫的作用，具有重要的生理功能[4]。人們對GPX的認識最早從動物開始，1957年，Mills[5]在提取哺乳動物紅細胞中的酶試驗H2O2反應時發現的。由于哺乳動物中的GPX利用谷胱甘肽（GSH）為電子供體還原H2O2及有機氫過氧化物等，故GPX名稱由此而來。相比之下，人們對植物GPX的研究開始較晚。第一個植物GPX的cDNA最早是從煙草中獲得[6]，后來相繼在擬南芥[7]、水稻[8]、番茄[9]、菠菜[10]、小麥[11]、茶樹[12]等植物中分離到GPX基因。近年來，對于植物GPXs的研究主要集中在生物脅迫（感染細菌、真菌或病毒）和非生物脅迫（如高溫、低溫、干旱、重金屬毒害、耐鹽等）方面。在生物脅迫條件下，RoeckelDrevet等[13]研究發現，當向日葵被一種霜霉病（Plasmoparahalstedii）感染后，GPXs基因的表達豐度顯著增加;Saidi等[14]研究發現，棗椰樹感染脆葉病（Brittleleafdisease）后，GPXs基因的表達水平在患病的根、葉中顯著提高。這些研究結果表明，在植物應對病害脅迫的過程中，GPXs基因可能發揮作用。

黃瓜細菌性角斑病于20世紀70年代在我國嚴重暴發，目前已是我國乃至世界上影響黃瓜生長的重要病害之一[15]，發病率在30%～50%，嚴重時可使植株中下部葉片全部壞死。目前黃瓜與細菌性角斑病相互作用的分子機理仍不清楚。該研究利用黃瓜葉cDNA文庫數據獲得了CsGPX編碼區全長序列，并對該序列進行生物信息學分析，預測其功能。在此基礎之上，采用qRT-PCR技術對黃瓜細菌性角斑病菌不同時間誘導下CsGPX基因的表達模式進行深入分析，以期為探求黃瓜的抗病機制提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料試驗中采用的黃瓜（CucumissativusL.）為抗病品種D0462，由東北農業大學園藝學院培育;細菌性角斑病（Pseudomonassyringaepv.Lachrymans）由東北農業大學園藝學院惠贈。誘導試驗在黃瓜3片真葉期開展，用噴霧器將1×108CFU/mL菌懸液均勻噴至葉面密布水珠但不流動為可。病原菌誘導0、8、24、48、72、96h后收集葉片，用無菌水沖洗3遍，濾紙吸干，迅速置于液氮中后于-80℃冰箱備用。

1.2方法

1.2.1黃瓜總RNA提取。

采用植物總RNA提取試劑盒提取黃瓜抗病品種D0462總RNA，具體步驟參照說明書進行。提取總RNA后采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用核酸分析儀檢測RNA的純度和濃度。

1.2.2CsGPX全長cDNA克隆。

根據前期所構建的黃瓜葉片cDNA文庫[16]，篩選獲得谷胱甘肽過氧化酶GPX基因cDNA全長序列并設計引物CF1、CR1（表1），以黃瓜cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系（50μL）：2×PCRMix25μL，正反引物CF1、CR1（20μmol/L）各1μL，cDNA模板2μL，不足的部分用ddH2O補足。PCR擴增條件：94℃預變性5min;94℃30s、57℃40s、72℃1min，35個循環;最后72℃延伸10min。將PCR產物送生物公司測序。

1.2.3序列分析。

使用NCBI中的開放閱讀框（openreadingframe，ORF）程序查找序列的ORF。分析ORF編碼的氨基酸序列采用ExPASy服務器上的ProtParamtool軟件（http：∥www.expasy.ch/cgi-bin/protparam）。CsGPX蛋白跨膜區、信號肽的預測和分析分別采用TMHMM（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、Signalp5.0（http：∥www.cds.dtu.dk/services/signal.p/）。通過NCBI中CDD程序（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）對CsGPX氨基酸序列的保守結構域進行分析。用Netphos3.1server（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）對CsGPX氨基酸序列進行潛在磷酸化位點分析。分別用Plant-mPloc（http：∥www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）和psortprediction（https：∥www.psort.hgc.jp/form.html）對CsGPX進行亞細胞定位分析。利用SOPMA（https：∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/sopma.html）對CsGPX氨基酸序列進行二級結構分析，CsGPX三級結構采用SWISS-model（https：∥swissmodel.expasy.org/）預測。

1.2.4熒光定量PCR分析。

采用qRT-PCR方法，對經黃瓜細菌性角斑病菌不同時間誘導下的CsGPX基因的表達情況進行檢測，分別提取侵染0、8、24、48、72、96h處理的黃瓜葉總RNA，反轉錄合成cDNA，取2μLcDNA為模板，加入SYBRPremixExTaqTM（2×）10μL，具體按寶生物工程大連有限公司說明書操作。在AgilentMx3000P型核酸擴增熒光檢測儀上進行RT-PCR，用于定量PCR的CsGPX基因的特異性引物（CF-qRT、CR-qRT）及內參引物（18S-F、18S-R）見表1。PCR反應條件：94℃預變性30s;94℃12s，56℃30s，72℃30s，40個循環，讀板溫度為81℃，擴增完成后采用2-ΔΔCt進行計算[17]。

2結果與分析

2.1總RNA的提取及檢測

提取黃瓜葉片總RNA，檢測結果如圖1所示，28SrRNA的亮度大約是18SrRNA的2倍，說明黃瓜總RNA完整性較好;經核酸蛋白檢測儀測得OD260/OD280比值為1.88，介于1.8～2.1，表明提取的RNA純度較高，可用于后續試驗。

2.2CsGPX基因全長cDNA的獲得

以黃瓜cDNA為模板，用特異性引物進行PCR擴增。由圖2可知，在1000bp附近得到1條CsGPX基因的特異片段，與預期大小相符。PCR產物經回收純化、測序后得到長度為914bp的序列。

2.3CsGPX全長序列分析

根據CsGPX全長測序結果，利用NCBI網站上的ORFFinder進行開放閱讀框查找，發現CsGPX的cDNA序列全長914bp，其中包含513bp的開放閱讀框，23bp的5′非翻譯區以及378bp的3′非翻譯區，編碼170個氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA（圖3）。通過與擬南芥的GPXs家族成員比較，發現有3個保守程度較高的特征結構域分別為VNVASKCGYT、ILAFPCNQF、KWNFTKFL，同時這3個結構域也是GPX的特征性基序。

2.3.1理化性質分析。

通過Protparam對CsGPX進行分析可知其分子式為C858H1341N223O257S4，相對分子質量為19.02kD，等電點（pI）為8.66，不穩定參數為24.23，蛋白質性質穩定（標準：40以下為穩定蛋白）。該蛋白中相對含量較多的氨基酸是Lys（10.0%，17個）、Leu（8.2%，14個）、Thr（7.6%，13個）。總的帶負電荷殘基（Asp+Glu）為19，總的帶正電荷殘基（Arg+Lys）為22。親水性平均系數為-0.369，預測該蛋白為親水性蛋白，其脂肪系數為78.00。TMHMM2.0分析顯示CsGPX無跨膜結構域。Signalp5.0分析結果表明該蛋白無信號肽。將CsGPX與部分擬南芥GPXs家族成員的理化性質進行比較，結果顯示CsGPX與AtGPX4在編碼氨基酸個數、等電點、相對分子質量、所帶正負電荷氨基酸的數量等方面均較相似（表2），因此可以推斷黃瓜CsGPX與AtGPX4可能具有相似的功能。

2.3.2保守結構域、磷酸化位點、亞細胞定位的分析。

通過NCBI中CDD程序對CsGPX氨基酸序列的保守結構域分析結果（圖4）顯示，該基因所表達的蛋白質具有典型的保守結構域GSH_Peroxidase，屬于硫氧還原蛋白超家族（thioredoxin-likesuperfamily）。用Netphos3.1server對CsGPX氨基酸序列進行潛在磷酸化位點分析，預測結果顯示，潛在的磷酸化位點位于Ser、Thr和Tyr3個氨基酸上，其中Ser為8，Thr為6，Tyr為3，共17個磷酸化位點。分別用PlantmPloc和psortprediction進行CsGPX的亞細胞定位，CsGPX可能在葉綠體、細胞質、線粒體等位置。

2.3.3蛋白質二級、三級結構的預測。

利用SOPMA對CsGPX氨基酸序列進行分析，其結果顯示CsGPX是由無規則卷曲、α螺旋、β轉角、延伸鏈等組成，其中，無規則卷曲（41.18%）為主要結構，無規則卷曲存在的部位往往與該蛋白質分子維持空間構象有著重要的聯系。

用SWISS-model對CsGPX的三級結構進行預測。由圖5（A）可看出，CsGPX有4個α螺旋和6個β折疊，與植物中GPX的經典結構一致;圖5（B）中3個帶黃色標記的是半胱氨酸位點，通過這個位置容易與氫過氧化物類的底物相結合，從而消除機體內過多的活性氧自由基。

2.4黃瓜CsGPX基因的表達特性分析

采用qRT-PCR方法分析經黃瓜細菌性角斑病菌誘導不同時間的CsGPX基因表達情況。結果如圖6所示，該基因在0～96h的表達水平呈現先升高（0～24h）后降低（24～48h）再升高（48～96h）的變化趨勢。整體看，CsGPX基因受病原菌誘導后（8～96h）的表達量均高于對照，最高可達對照表達量的363.5倍。由此說明，CsGPX基因明顯受黃瓜細菌性角斑病菌的誘導，推測該基因可能參與黃瓜細菌性病害的防御，在抵御生物脅迫中發揮作用。

3討論與結論

GPXs是生物體內至關重要的活性氧自由基清除劑，可催化谷胱甘肽（GSH）轉化為氧化型谷胱甘肽（GSSG），將有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，同時也可以促進H2O2的分解，從而保護細胞膜的結構及功能不遭受損害[18]。與動物相比，對植物中GPX的研究起步較晚。有研究表明，GPX氨基酸序列攜帶的是一個半胱氨酸殘基，替代了動物基因組GPX核苷酸UGA終止密碼子處插入的硒代半胱氨酸[19]，即植物中的GPX蛋白不含有硒。GPXs常作為植物抗逆指標，用來反映植物的氧化脅迫傷害程度和評價該植物的抗逆能力。當植物遭受病原菌侵染[13]、高鹽[20]、重金屬[21]、干旱[22]、低溫[23]等不同生物和非生物脅迫時，多數GPX的表達及活性會增強。目前，對植物GPXs的研究多集中在非生物脅迫中的功能作用。如煙草中過量表達NtGPX基因能夠減少活性氧導致的膜損傷，提高煙草的耐鹽性及抗凍性[24]。番茄中過表達LePHGPX基因可提高其耐高溫脅迫的能力[25]。而有關于GPXs在生物脅迫中的功能作用研究相對較少。

黃瓜細菌性角斑病是黃瓜的一類重要細菌性病害，近年來，黃瓜細菌性角斑病幾乎遍布全國各個黃瓜產區，嚴重時可導致整個溫室的黃瓜發病死亡，發病率達100%[26]。目前黃瓜細菌性角斑病以化學防治為主，然而化學防治一方面會給環境和人類帶來危害，另一方面還會引起病原物的抗藥性，加重該病害防治的難度。因此，深入了解寄主植物與病原物的互作關系可為黃瓜細菌性角斑病的有效防治提供參考。

該研究通過對黃瓜CsGPX基因cDNA全長序列進行克隆和分析，獲得全長cDNA序列914bp，包含一個513bp的開放閱讀框，編碼170個氨基酸，蛋白質性質穩定。通過與擬南芥GPXs比較發現，CsGPX與擬南芥具有相似的典型保守結構，無信號肽和跨膜結構，共有17個磷酸化位點，一般來說，氨基酸序列中的磷酸化位點越多，該蛋白越可能會發揮更多功能[27]。根據CsGPX的亞細胞定位可以推測該基因可能與光合作用、生理生化反應、能量傳遞、信號轉導等有關。為進一步了解CsGPX在黃瓜抗病方面的功能，深入分析細菌性角斑病菌侵染下黃瓜CsGPX基因的表達模式，發現CsGPX的表達顯著提高，最高可達對照表達量的363.5倍，說明該基因明顯受黃瓜細菌性角斑病菌的誘導。該結果可為研究CsGPX基因在黃瓜抗病方面的功能以及解析黃瓜與病原物互作網絡提供重要依據。

參考文獻

[1]RODRIGUEZMILLAMA，MAURERA，RODRIGUEZHUETEA，etal.GlutathioneperoxidasegenesinArabidopsisareubiquitousandregulatedbyabioticstressesthroughdiversesignalingpathways[J].PlantJ，2003，36（5）：602-615.

[2]杜秀敏，殷文璇，趙彥修，等.植物中活性氧的產生及清除機制[J].生物工程學報，2001，17（2）：121-125.

[3]苗雨晨，白玲，苗琛，等.植物谷胱甘肽過氧化物酶研究進展[J].植物學通報，2005，40（3）：350-356.

[4]FLOHL，GNZLERWA.Assaysofglutathioneperoxidase[J].MethodsEnzymol，1984，105（1）：114-121.

[5]MILLSGC.Hemoglobincatabolism：I.Glutathioneperoxidase，anerythrocyteenzymewhichprotectshemoglobinfromoxidativebreakdown[J].JBiolChem，1957，229（1）：189-197.

[6]CRIQUIMC，JAMETE，PARMENTIERY，etal.IsolationandcharacterizationofaplantcDNAshowinghomologytoanimalglutathioneperoxidases[J].PlantMolBiol，1992，18（3）：623-627.

[7]SUGIMOTOM，SAKAMOTOW.PutativephospholipidhydroperoxideglutathioneperoxidasegenefromArabidopsisthalianainducedbyoxidativestress[J].GenesGenetSyst，1997，72（5）：311-316.

[8]LIWJ，FENGH，FANJH，etal.MolecularcloningandexpressionofaphospholipidhydroperoxideglutathioneperoxidasehomologinOryzasativa[J].BiochimetBiophysActa（BBA）GeneStructExpr，2000，1493（1/2）：225-230.

[9]DEPEGEN，DREVETJ，BOYERN.MolecularcloningandcharacterizationoftomatocDNAsencodingglutathioneperoxidaselikeproteins[J].EurJBiochem，1998，253（2）：445-451.

[10]SUGIMOTOM，FURUIS，SUZUKIY.MolecularcloningandcharacterizationofacDNAencodingputativephospholipidhydroperoxideglutathioneperoxidasefromspinach[J].BiosciBiotechnolBiochem，1997，61（8）：1379-1381.

[11]張蕾，于永昂，張明霞，等.小麥GPX基因的克隆及植物表達載體構建[J].貴州農業科學，2015，43（4）：31-34.

[12]劉賽，劉碩謙，龍金花，等.茶樹谷胱甘肽過氧化物酶編碼基因CsGPX1功能分析[J].茶葉科學，2019，39（4）：382-391.

[13]ROECKELDREVETP，GAGNEG，DELABROUHEDT，etal.Molecularcharacterization，organdistributionandstressmediatedinductionoftwoglutathioneperoxidaseencodingmRNAsinsunflower（Helianthusannuus）[J].PhysiolPlant，1998，103（3）：385-394.

[14]SAIDIMN，JBIRR，GHORBELI，etal.Brittleleafdiseaseinducesanoxidativestressanddecreasestheexpressionofmanganeserelatedgenesindatepalm（PhoenixdactyliferaL.）[J].PlantPhysiolBiochem，2012，50（1）：1-7.

[15]孫福在，何禮遠.黃瓜細菌性角斑病病原菌與寄主范圍鑒定[J].植物病理學報，1988，18（1）：23-28.

[16]劉關君，王麗娟，秦智偉，等.黃瓜葉片細菌性角斑病侵染初期cDNA文庫分析[J].遺傳，2009，31（10）：1042-1048.

[17]LIVAKKJ，SCHMITTGENTD.AnalysisofrelativegeneexpressiondatausingrealtimequantitativePCRandthe2-ΔΔCTmethod[J].Methods，2001，25（4）：402-408.

[18]齊增園，陶鵬，李必元，等.白菜谷胱甘肽過氧化物酶基因GPX的鑒定與分析[J].浙江農業學報，2016，28（1）：64-69.

[19]ESHDATY，HOLLANDD，FALTINZ，etal.Plantglutathioneperoxidases[J].PhysiolPlant，1997，100（2）：234-240.

[20]HOLLANDD，BENHAYYIMG，FALTINZ，etal.Molecularcharacterizationofsaltstressassociatedproteinincitrus：ProteinandcDNAsequencehomologytomammalianglutathioneperoxidases[J].PlantMolBiol，1993，21（5）：923-927.

[21]NAVROTN，COLLINV，GUALBERTOJ，etal.Plantglutathioneperoxidasesarefunctionalperoxiredoxinsdistributedinseveralsubcellularcompartmentsandregulatedduringbioticandabioticstresses[J].PlantPhysiol，2006，142（4）：1364-1379.

[22]FERREIRANETOJRC，PANDOLFIV，GUIMARAESFC，etal.Earlytranscriptionalresponseofsoybeancontrastingaccessionstorootdehydration[J].PLoSOne，2013，8（12）：1-20.

[23]KIMYJ，JANGMG，NOHHY，etal.MolecularcharacterizationoftwoglutathioneperoxidasegenesofPanaxginsengandtheirexpressionanalysisagainstenvironmentalstresses[J].Gene，2014，535（1）：33-41.

[24]ROXASVP，LODHISA，GARRETTDK，etal.StresstoleranceintransgenictobaccoseedlingsthatoverexpressglutathioneStransferase/glutathioneperoxidase[J].PlantCellPhysiol，2000，41（11）：1229-1234.

[25]CHENSR，VAGHCHHIPAWALAZ，LIW，etal.TomatophospholipidhydroperoxideglutathioneperoxidaseinhibitscelldeathinducedbyBaxandoxidativestressesinyeastandplants[J].PlantPhysiol，2004，135（3）：1630-1641.

[26]陳璐.黃瓜細菌性角斑病菌和多主棒孢菌PCR檢測技術的建立[D].北京：中國農業科學院，2014.

[27]周立敬，周宜君，高飛，等.擬南芥谷胱甘肽過氧化物酶的生物信息學分析[J].中央民族大學學報（自然科學版），2010，19（2）：11-17.