加壓CO₂與熱巴氏殺菌對原料乳殺菌效果的對比研究

摘要 [目的]比較加壓CO2與熱巴氏殺菌對原料乳的殺菌效果。[方法]選擇不同的CO2壓力、加壓時間和溫度，研究加壓CO2殺菌和熱巴氏殺菌對原料乳中天然菌群的殺菌效果。[結果]CO2壓力、加壓時間、溫度對殺菌效果影響顯著，且隨著壓力、溫度和時間的增加，殺菌率明顯提高。[結論]當CO2壓力為7 MPa、溫度為4 ℃、處理時間為60 min時，加壓CO2殺菌方法殺菌效果最優。

關鍵詞 加壓CO2;熱巴氏殺菌;殺菌效果

中圖分類號 TS252文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2021）07-0174-03

Abstract [Objective] To compare the bactericidal effect of pressurized CO2 sterilization and hot pasteurization on the natural flora in raw milk. [Method] Different CO2 pressure， pressurization time and temperature were selected. [Result] The results showed that CO2 pressure， time and temperature had significant effects on the bactericidal effect， and the bactericidal rate increased with the increase of pressure， temperature and time. [Conclusion] After sterilized by CO2， the number of bacteria in the raw milk decreased. When the pressure was 7 MPa， the temperature was 4 ℃， and the treatment time was 40 min， the result is optimal.

Key words Pressurized carbon dioxide;Hot pasteurization;Sterilization effect

作者簡介 沈培奇（1983—），男，廣西南寧人，講師，碩士，從事食品加工和烹調工藝研究。

對于熱敏感性食品，熱巴氏殺菌不僅會降低食品的感官品質，還會影響食品的營養品質，因此非熱殺菌自提出后逐漸被認可[1]。CO2具有抑菌作用，在10 MPa以下的低壓力時，加壓CO2殺菌具有較好的殺菌效果[2]。CO2的費用低，來源廣泛，容易從產品中分離[3]。目前，有關高密度CO2殺菌技術在微生物殺滅研究方面的報道逐年增多，這充分說明該殺菌技術應用的發展潛力巨大[4-5]。

CO2加壓殺菌技術在果汁、肉制品以及固體食品中的研究較多[6-9]，但是對原料乳的研究相對較少，且對單一菌種的研究較多，對于原料乳整體微生物研究較少。筆者比較了加壓CO2殺菌和熱巴氏殺菌2種方式對原料乳中天然菌群的殺菌效果，旨在為拓展CO2殺菌的應用范圍提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 原料乳購于當地牧場、當地農場。 CO2氣體，食品級，濃度（V/V）≥99.9，購于當地黎明氣體有限公司。

1.2 方法

選擇原料乳中最常見的致病菌（金黃色葡萄球菌和腸桿菌科細菌）以及最常見的腐敗菌（假單胞菌和乳酸菌）作為目標菌群，采用連續加壓方式，時間分別為30、60 min。

1.2.1 不同處理壓力對原料乳的殺菌效果。樣品1為空白對照，樣品2為巴氏殺菌處理（63 ℃ 30 min），樣品3、4為室溫25 ℃下CO2壓力分別為7、9 MPa，連續加壓20 min，對處理后樣品中的假單胞菌、腸桿菌科細菌、乳酸菌、金黃色葡萄球菌和細菌總數的殺菌率進行測定。

1.2.1.1 加壓CO2 殺菌方法。通入CO2氣體，排除空氣，加入50 mL懸菌液，通入CO2至一定壓力，在保壓過程中為了保持菌液的懸浮狀態，使用磁力攪樣器攪拌。

1.2.1.2 巴氏殺菌處理方法。原料乳的熱巴氏殺菌處理在加壓設備中進行[10]，關閉CO2氣體進氣閥，使反應在大氣壓下進行。水浴溫度63 ℃，保持30 min。熱巴氏殺菌處理以后，將原料乳樣品無菌取出，測定樣品中假單胞菌、乳酸菌、腸桿菌科細菌、金黃色葡萄球菌、細菌總數。

1.2.2 不同處理時間對原料乳的殺菌效果。樣品1為空白對照，樣品2為巴氏殺菌處理（63 ℃ 30 min），樣品3、4分別為室溫25 ℃ 7 MPa CO2壓力，連續加壓30、60 min。對處理樣品中的假單胞菌、腸桿菌科細菌、乳酸菌、金黃色葡萄球菌和細菌總數的殺菌率進行測定。

1.2.3 不同處理溫度對原料乳的殺菌效果。樣品1為空白對照，樣品2為巴氏殺菌處理（63 ℃ 30 min），樣品3、4分別為室溫4、25 ℃下7 MPa CO2壓力，連續加壓60 min。對處理后樣品中的假單胞菌、腸桿菌科細菌、乳酸菌、金黃色葡萄球菌和細菌總數的殺菌率進行檢測。

1.2.4 各類菌落數的測定。

1.2.4.1 腸桿菌科。瓊脂培養基（VRBGA）配比：酵母浸膏3 g，乳糖10 g，蛋白胨7 g，膽鹽1.5 g，氯化鈉 5 g，中性紅0.03 g，結晶紫0.002 g，瓊脂15 g，1 000 mL蒸餾水，調節培養基pH為7.3～7.5，滅菌溫度121 ℃，時間15 min。細菌30 ℃培養48 h后開始計數。

1.2.4.2 乳酸菌。瓊脂培養基（MRS）配比：磷酸氫二鉀和檸檬酸銨2 g，蛋白和牛肉膏10 g，酵母浸膏5 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.58 g，葡萄糖20 g，80 mL吐溫，瓊脂 15 g，碳酸鈣20 g和硫酸錳0.25 g，1 000 mL蒸餾水，調節培養基的pH至6.2～6.4，滅菌溫度121 ℃、時間15 min。細菌30 ℃培養48 h后開始計數。

1.2.4.3 金黃色葡萄球菌。瓊脂培養基（Baird-Parker）配比：將Baird-Parker瓊脂培養基加水溶解并分裝每瓶95 mL，121 ℃滅菌15 min。將溫度冷卻至50 ℃，增菌劑卵黃亞碲酸鉀預熱50 ℃，在培養基中加入增菌劑5 mL，搖勻后傾注平板，備用。培養基致密不透明，使用前在冰箱存放的時間不得超過48 h。細菌30 ℃培養48 h后開始計數[11]。

1.2.4.4 細菌總數。培養條件：PCA培養基，37 ℃ 48 h，培養基配制方法：營養瓊脂45 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌15 min。

細菌殺菌率計算公式如下：

殺菌率（%）=N0-NN0×100

式中，N0為處理前細菌數（CFU/mL）;N為處理后細菌存活數（CFU/mL）。

1.2.4.5 假單胞菌的測定。瓊脂培養基（CFC）的配制：20 g蛋白胨，1.4 g MgCl2，1.0 g無水硫酸鉀，13.6 g瓊脂，甘油10 mL，1 000 mL蒸餾水，121 ℃滅菌15 min。細菌的培養溫度為25 ℃，在培養基中培養48 h后開始計數。

1.2.5 數據分析。試驗數據用Excel軟件整理統計，利用SPSS 17.0軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同壓力CO2加壓與巴氏殺菌處理的殺菌效果對比

CO2能夠快速有效穿透菌體細胞壁[12-13]，該試驗應用的壓力分別是7、9 MPa。由圖1可知，當壓力從7 MPa增加至9 MPa時，對所有菌的殺滅能力增大，各種菌總數顯著降低（P<0.05）。這與GarciaGonzalez等[14]研究結果一致。通常認為，增強的CO2殺菌作用是由于增加的CO2溶解在細胞外基質中[15-16]，CO2的擴散性會隨著溶解性的增加而增加，且菌體細胞膜的完整性發生改變，菌體細胞膜的流動性也會隨著溶解性增加而增加。

9 MPa CO2壓力處理的樣品，假單胞菌菌數降低到2.37 log CFU/mL，高于熱巴氏殺菌后的假單胞菌菌數2.29 log CFU/mL（P>0.05）;腸桿菌科細菌菌數是2.46 log CFU/mL，仍然顯著高于熱巴氏殺菌后的腸桿菌菌數1.10 log CFU/mL（P<0.05）;乳酸菌的菌數是3.45 log CFU/mL，細菌總數是3.96 log CFU/mL，均高于熱巴氏殺菌處理的乳酸菌菌數（3.12 log CFU/mL）和細菌總數（3.26 log CFU/mL），但差異均不顯著（P>0.05）;熱巴氏殺菌后檢測不到金黃色葡萄球菌，冷殺菌后能夠檢出2.17 log CFU/mL。熱巴氏殺菌較加壓CO2處理能更好地除去金黃色葡萄球菌，與革蘭氏陰性菌相比，對于加壓CO2處理更加具有抵抗力的是革蘭氏陽性菌。此外，CO2壓力從7 MPa增加至9 MPa時，細菌總數的變化均不顯著（P>0.05）。

2.2 CO2加壓處理不同時間與巴氏殺菌處理的殺菌效果對比

從圖2可知，加壓30 min處理假單胞菌菌數、腸桿菌科細菌菌數、乳酸菌菌數、細菌總數、金黃色葡萄球菌菌數分別降低1.44、1.69、0.60、1.40和1.01 log CFU/mL（P<0.05）。當越來越多的CO2分子進入到微生物細胞時，菌體細胞內pH也會逐漸降低。加壓60 min處理后，假單胞菌菌數降低到2.13 log CFU/mL，低于熱巴氏殺菌后的假單胞菌菌數282 log CFU/mL（P<0.05）;腸桿菌科細菌菌數是1.34 log CFU/mL，低于熱巴氏殺菌后的腸桿菌細菌的菌數1.49 log CFU/mL（P>0.05）;細菌總數是3.55 log CFU/mL，低于熱巴氏殺菌后的細菌總數4.13 log CFU/mL（P>0.05）;但是乳酸菌菌數為3.37 log CFU/mL，仍然高于熱巴氏殺菌后的乳酸菌菌數3.23 log CFU/mL（P>0.05）。在牛乳中可以檢測到金黃色葡萄球菌的存在。以上結果說明，與熱巴氏殺菌相比，加壓CO2處理60 min，同樣能有效降低樣品中的腸桿菌科細菌菌數、假單胞菌菌數和細菌總數。CO2加壓處理60、30 min，細菌總數分別為3.55、4.50 log CFU/mL，與熱巴氏殺菌相比，差異不顯著（P>0.05）。

2.3 不同溫度下加壓CO2與巴氏殺菌處理的殺菌效果對比

GarciaGonzalez等[13]研究表明，升高溫度可以提高殺菌能力。但考慮到實際運輸原料乳的需要，選擇冷藏溫度4 ℃作為加壓CO2處理溫度。

由圖3可知，在4 ℃下，7 MPa連續加壓CO2 60 min處理，假單胞菌菌數降低到2.15 log CFU/mL，與熱巴氏殺菌（3.03 log CFU/mL）相比，差異顯著（P<0.05）;腸桿菌科細菌菌數是1.18 log CFU/mL，顯著低于熱巴氏殺菌后的腸桿菌細菌菌數1.84 log CFU/mL（P<0.05）;細菌總數是3.65 log CFU/mL，低于熱巴氏殺菌后的細菌總數3.81 log CFU/mL（P>0.05）。但是乳酸菌菌數3.04 log CFU/mL高于熱巴氏殺菌后的乳酸菌菌數2.93 log CFU/mL（P>0.05）。在該條件下處理后，樣品中檢測不到金黃色葡萄球菌。

與25 ℃處理相比，4? ℃處理能夠更好地殺滅原料乳樣品中的天然微生物。在4 ℃下，假單胞菌、腸桿菌科細菌、乳酸菌、細菌總數和金黃色葡萄球菌的菌數分別降低了2.44、269、1.54、2.25和3.39 log CFU/mL。在25 ℃處理后，假單胞菌、腸桿菌科細菌、乳酸菌、細菌總數、金黃色葡萄球菌的菌數分別降低了0.72、1.89、0.13、0.45和1.81 log CFU/mL。在4 ℃時微生物新陳代謝較慢，生長受到抑制。綜上，4 ℃處理的殺菌效果優于25 ℃處理以及熱巴氏殺菌。

3 結論

加壓CO2處理可使原料乳中假單胞菌、腸桿菌科細菌、乳酸菌和金黃色葡萄球菌菌數和細菌總數降低，且CO2壓力、加壓時間以及溫度的改變對殺菌效果影響較大。當壓力為7 MPa、溫度為4 ℃、時間為60 min時，殺菌效果最佳，原料乳中各細菌數量均下降，且未檢測出金黃色葡萄球菌。因此，在對牛乳進行冷藏前，與傳統巴氏殺菌相比，加壓CO2處

理可使原料乳的保藏期更長，為乳制品的滅菌處理方式提供了更多有效的選擇。

參考文獻

[1] POSSAS A，PREZRODRGUEZ F，VALERO A，et al.Modelling the inactivation of Listeria monocytogenes by high hydrostatic pressure processing in foods：A review[J].Trends in food science & technology，2017，70：45-55.

[2] PANIAGUAMARTNEZ I，MULET A，GARCAALVARADO M A，et al.Orange juice processing using a continuous flow ultrasoundassisted supercritical CO2，system：Microbiota inactivation and product quality[J].Innovative food science & emerging technologies，2018，47：362-370.

[3] 孫彥琳，蘇樹朋，韓立英，等.高壓CO2與超高壓均質協同殺菌裝置的研發[J].食品與機械，2017，33（1）：84-86.

[4] FERRENTINO G，PLAZA M L，RAMIREZRODRIGUES M，et al.Effects of dense phase carbon dioxide pasteurization on the physical and quality attributes of a red grapefruit juice [J].Journal of food science，2009，74（6）：E333-E341.

[5] SPILIMBERGO S，CIOLA L.Supercritical CO2 and N2O pasteurisation of peach and kiwi juice [J].International journal of food science & technology，2010，45（8）：1619-1625.

[6] RAO L，BI X F，ZHAO F，et al.Effect of highpressure CO2 processing on bacterial spores[J].Critical reviews in food science and nutrition，2016，56（11）：1808-1825.

[7] PRAMUDITA I E，NOVIANA M L，MULJANA H.Study of pretreatment and enzymatic hydrolysis on microcrystalline cellulose and HVS A4 paper in pressurized CO2 media[J].Modern applied science，2015，9（7）：16-23.

[8] LI H，ZHAO L，WU J H，et al.Inactivation of natural microorganisms in litchi juice by highpressure carbon dioxide combined with mild heat and nisin[J].Food microbiology，2012，30（1）：139-145.

[9] 周先漢，張安，曾慶梅，等.超臨界CO2殺滅芽孢工藝條件的優化[J].安徽農業科學，2010，38（17）：9201-9203.

[10] 王桂楨，陳忠澤.巴氏殺菌工藝的改進研究[J].中國乳業，2017（3）：61-65.

[11] 高璇.市售鮮牛奶中金黃色葡萄球菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].安徽農業科學，2018，46（27）：173-175.

[12] AMARAL G V，SILVA E K，CAVALCANTI R N，et al.Dairy processing using supercritical carbon dioxide technology：Theoretical fundamentals，quality and safety aspects[J].Trends in food science & technology，2017，64：94-101.

[13] GARCIAGONZALEZ L，GEERAERD A H，SPILIMBERGO S，et al.High pressure carbon dioxide inactivation of microorganisms in foods：The past，the present and the future [J].International journal of food microbiology，2007，117（1）：1-28.

[14] GARCIAGONZALEZ L，GEERAERD A H，ELST K，et al.Inactivation of naturally occurring microorganisms in liquid whole egg using high pressure carbon dioxide processing as an alternative to heat pasteurization [J].The journal of supercritical fluids，2009，51（1）：74-82.

[15] ILLERA A E，SANZ M T，TRIGUEROS E，et al.Effect of high pressure carbon dioxide on tomato juice：Inactivation kinetics of pectin methylesterase and polygalacturonase and determination of other quality parameters[J].Journal of food engineering，2018，239：64-71.

[16] 祖林林.高壓CO2對全蛋液的殺菌效果及機理的初探[D].武漢：華中農業大學，2018.