毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3在肝門部膽管癌中表達及臨床意義 *

張宏偉， 王彩茹 ， 繆國東， 張化玉

(河北省承德市中心醫(yī)院普外科， 河北 承德 067000)

肝門部膽管癌是起源于膽管上皮細胞惡性腫瘤。肝門部膽管癌惡性度極高，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和神經(jīng)浸潤，且早期診斷率低。肝門部膽管癌對放、化療不敏感，目前對肝門部膽管癌治療的主要方法是手術切除，但切除率較低，且術后易復發(fā)。膽管癌患者預后差，主要原因是膽管癌早期發(fā)展過程中發(fā)生周圍神經(jīng)浸潤[1]。文獻報告，膽管癌細胞可侵入周圍神經(jīng)叢發(fā)生神經(jīng)浸潤，從而發(fā)生轉(zhuǎn)移[2]。毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3(Muscarinic acetylcholine receptor M3，CHRM3)屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，是乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)受體。膽管周圍神經(jīng)遞質(zhì)的分泌對膽管癌神經(jīng)浸潤具有促進作用。范帥等[3]研究發(fā)現(xiàn)膽管癌神經(jīng)浸潤可能是通過激活CHRM3來促進癌細胞轉(zhuǎn)移。本研究采用免疫組化法檢測CHRM3在肝門部膽管癌組織中表達情況，并探討CHRM3與肝門部膽管癌預后的關系，旨在明確CHRM3對評估患者預后方面的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2013年1月至2017年4月本院收集的手術切除的69例肝門部膽管癌組織及69例膽管癌癌旁正常膽管組織為研究對象。其中男性44例，女性25例；年齡50～75歲，平均年齡(58.37±8.16)歲；病理分期：Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期44例；病理分級：低、中分化42例，高分化27例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例；有神經(jīng)浸潤41例，無神經(jīng)浸潤28例。納入標準：①癌組織經(jīng)專家鑒定均為肝門部膽管癌病理組織，病理組織符合肝門部膽管癌鑒定標準[4]；②首次患肝門部膽管癌；③患者臨床資料完整，術后配合完成此試驗。排除標準：①并發(fā)其它惡性腫瘤患者；②曾經(jīng)接受過放化療患者；③肝、腎功能嚴重異常患者；④有凝血功能障礙患者。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準通過。患者及直系親屬對本研究知情，并簽訂知情同意書。

1.2主要試劑及儀器:CHRM3抗體(批號：bs-4918R-2)購自上海恒斐生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG二抗(批號：170-6516)購自深圳市安提生物科技有限公司；SPCC-200型生物顯微鏡購自東莞市譜標實驗器材科技有限公司；RM2016型輪轉(zhuǎn)式切片機購自德國徠卡公司。

1.3研究方法

1.3.1免疫組化法檢測肝門部膽管癌組織及癌旁組織中CHRM3表達水平:肝門部膽管癌組織及癌旁組織先用10%甲醛固定，再用石蠟包埋，然后切片。切厚度約3～4μm的切片。使用二甲苯對切片進行脫蠟，然后在80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇分別進行洗脫2min，待切片無水乙醇干燥后，加入鼠抗人CHRM3抗體作為一抗，4℃冰箱過夜，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗三次，再滴加羊抗鼠二抗，進行37℃孵育40min，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，中性樹膠封固。微鏡下觀察拍照鏡片結(jié)果。用試劑盒提供的陽性的病理切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為空白對照。

1.3.2結(jié)果判定:每個實驗結(jié)果由三位專業(yè)人員獨立判斷評定。置于顯微鏡下進行觀察。CHRM3表達于細胞膜及細胞質(zhì)，陽性表達為淺黃色、棕黃色或褐色顆粒。根據(jù)細胞染色強度，陽性強度評分：無色記0分，淺黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。任意選擇3～5個高倍鏡視野下(×400)陽性細胞百分比進行計分，評分標準：0分(細胞數(shù)<5%)；1分(細胞數(shù)為5%～25%)；2分(細胞數(shù)為26%～50%)；3分(細胞數(shù)>51%)。根據(jù)染色指數(shù)(即染色強度與陽性細胞所占比例的評分乘積)大小將免疫組化結(jié)果進行等級劃分：0分代表為陰性(-)，1～4分代表為弱陽性(+)，5～8分代表陽性(++)，9～12分代表強陽性(+++)。其中0～4記為陰性表達，≥5分記為陽性表達。

1.4隨訪:對所有肝門部膽管癌患者均接受常規(guī)隨訪，隨訪時間3年，術后第一年內(nèi)每隔4個月讓患者入院復查一次，術后第2、3年，每半年讓患者入院復查一次，并每3個月對患者進行電話隨訪，記錄肝門部膽管癌患者生存死亡情況。本次隨訪截止日期為2020年4月30日，死亡患者以死亡時間作為隨訪截止日期。

2 結(jié) 果

2.1CHRM3在肝門部膽管癌組織上的表達水平:CHRM3陽性表達于細胞膜及細胞質(zhì)出現(xiàn)呈棕黃色或褐色顆粒。CHRM3在癌旁組織和肝門部膽管癌組織陽性率分別為7.25%和84.06%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 CHRM3在肝門部膽管癌旁組織和癌組織中表達(HE染色，×200，箭頭表示肝門部膽管組織染色區(qū)域)

圖2 CHRM3表達與肝門部膽管癌患者生存率的關系

2.2CHRM3表達水平與肝門部膽管癌臨床病理特征的關系:肝門部膽管癌組織中CHRM3表達水平與年齡、性別無關(P>0.05)，與病理分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)浸潤有關(P<0.05)。見表2。

2.3CHRM3表達水平與肝門部膽管癌患者生存率的關系:Kaplan-Meier法顯示CHRM3陰性肝門部膽管癌患者平均生存時間為(33.69±0.76)個月，顯著長于CHRM3陽性肝門部膽管癌患者(23.37±1.02)個月(t=5.029，P=0.025)。見圖2。

表1 CHRM3在肝門部膽管癌組織及癌旁組織中表達水平n(%)

表2 CHRM3表達水平與肝門部膽管癌臨床病理特征的關系n(%)

表3 影響肝門部膽管癌患者預后的危險因素分析

2.4影響肝門部膽管癌患者預后的危險因素分析:單因素分析表明，病理分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)浸潤、CHRM3陽性均是影響肝門部膽管癌患者不良預后的危險因素。多因素分析表明，神經(jīng)浸潤、CHRM3陽性是影響肝門部膽管癌患者不良預后的獨立危險因素(HR=2.020，95% CI為1.574～2.593；HR=2.303，95% CI為1.259～3.468，P均<0.05)。見表3。

3 討 論

膽管癌包括肝內(nèi)膽管癌和肝外膽管癌。肝門部膽管癌發(fā)生于神經(jīng)纖維外部，神經(jīng)浸潤是其癌細胞轉(zhuǎn)移的獨立的形式[5]。膽管癌細胞神經(jīng)浸潤方式主要為神經(jīng)周圍間隙內(nèi)生長，其次為神經(jīng)纖維內(nèi)彌漫性生長。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤主病灶區(qū)無神經(jīng)纖維分布，但在腫瘤由肝門部膽管壁向周圍組織浸潤生長后，易發(fā)生腫瘤神經(jīng)浸潤。

腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移與神經(jīng)遞質(zhì)及其受體密切相關[6]。有文獻報道，腫瘤細胞可沿神經(jīng)突觸向神經(jīng)節(jié)遷移生長，腫瘤細胞的遷移具有方向性[7]。CHRM簡稱M受體，是一種單鏈跨膜糖蛋白，由460～590個氨基酸組成，在周圍神經(jīng)系統(tǒng)的腺體分泌、平滑肌收縮等中具有重要作用[8]。CHRM3是M受體中的一種，是參與分泌液體的外分泌腺細胞的G蛋白偶聯(lián)受體，由七個跨膜結(jié)構(gòu)域組成，在外分泌腺、神經(jīng)和血管平滑肌等不同的器官系統(tǒng)中均有表達[9,10]。CHRM3在多種腫瘤細胞中具有表達，且可與多種信號通路相連，發(fā)揮促進腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移的作用。活化后的CHRM3能激活下游的mRNA，進而調(diào)控不同信號通路，促使細胞發(fā)揮不同的功能。Vasamsetti等[11]研究顯示，結(jié)腸癌組織中檢測到CHRM3過度表達，其表達較正常結(jié)腸組織增加了2～128倍，CHRM3的活化促進了結(jié)腸癌胞的增殖、侵襲和遷移。大多數(shù)來源于上皮細胞和內(nèi)皮細胞的癌細胞可合成和釋放乙酰膽堿，扮演著自分泌和旁分泌生長因子角色，可刺激細胞生長。Felton等研究顯示[12]在結(jié)腸癌中，CHRM3活化可促進結(jié)腸癌細胞的侵襲和遷移。肝臟由交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)系統(tǒng)共同支配，這些神經(jīng)來源于圍繞門靜脈、肝動脈和膽管的內(nèi)臟神經(jīng)和迷走神經(jīng)。在肝癌中發(fā)現(xiàn)，肝臟受迷走神經(jīng)支配，迷走神經(jīng)可釋放神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，乙酰膽堿能夠與肝癌細胞上CHRM3結(jié)合，使CHRM3活化，活化的CHRM3可激活其下游磷酯酰肌醇-3-激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信號通路，從而誘導肝癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移[13]。關于CHRM3，在前期研究中發(fā)現(xiàn)[14]膽管周圍分泌的神經(jīng)遞質(zhì)會誘發(fā)膽管癌神經(jīng)浸潤，而膽管周圍分泌的神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用主要依靠CHRM3。本研究發(fā)現(xiàn)CHRM3在癌旁組織陽性率顯著低于肝門部膽管癌組織陽性率，提示CHRM3可能與肝門部膽管癌發(fā)生有關。病理分析發(fā)現(xiàn)肝門部膽管癌組織中CHRM3表達水平與年齡、性別無關，與病理分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)浸潤有關，提示CHRM3可能影響肝門部膽管癌病情發(fā)展，猜測CHRM3可能通過促進肝門部膽管癌細胞神經(jīng)浸潤發(fā)生從而促進病情發(fā)展。Kaplan-Meier法顯示CHRM3陰性肝門部膽管癌患者平均生存時間顯著長于CHRM3陽性肝門部膽管癌患者，多因素分析表明，神經(jīng)浸潤、CHRM3陽性是影響肝門部膽管癌患者不良預后的獨立危險因素，提示CHRM3陽性患者可能易發(fā)生腫瘤復發(fā)，對該部分患者在治療和術后恢復中應及時發(fā)現(xiàn)、治療，避免不良預后。綜上所述，CHRM3在肝門部膽管癌組織中陽性表達率顯著上升，與病理分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)浸潤有關，有望成為肝門部膽管癌預后的監(jiān)測指標。但本研究中CHRM3參與肝門部膽管癌發(fā)生發(fā)展的機制有待進一步探究。