急性粒單核細胞白血病患者骨髓NOV基因表達與預后的相關性 *

彭恩蘭， 冀建峰， 熊 勰， 柯傳慶

(中國人民解放軍聯勤保障部隊第908醫院， 江西 南昌 330002)

急性粒單核細胞白血病(acute myelomonocytic leukemia，AMML)屬于造血系統的克隆性惡性疾病，約占急性髓細胞性白血病(髓系造血干/祖細胞惡性疾病)的6.2%，可見于任何年齡，但多見于老年人[1]。目前臨床治療AMML的主要手段是支持治療及化療，雖然可在一定程度上緩解患者癥狀，但部分老年患者常常合并髓外浸潤、染色體核型異常比例高等情況，加之化療耐受性較弱，預后不佳[2]。近年，雖有研究[3]發現泛素羧基末端水解酶蛋白(BRCA1 associated protein 1，BAP1)可能與白血病的發病有一定聯系，這也在一定程度上提高急性髓細胞白血病診治水平，但目前尚未發現與AMML發生、發展及預后相關的分子標志物。故尋求可早期預測AMML患者預后的指標成為研究熱點，對指導臨床治療AMML具有重要意義。腎母細胞瘤過度表達基因(nephroblastoma over-expressed gene，NOV)是一種胰島素樣生長因子結合蛋白，在調節細胞的增殖、分化及血管形成等過程中發揮重要作用。研究[4]顯示，NOV表達參與多種腫瘤的發生及發展過程，且在腫瘤中的表達多種多樣，作用機制也不同，甚至完全相反，且在慢性髓系白血病中具有負向調節作用。故而推測NOV表達與AMML患者的預后可能存在一定聯系，但目前與之相關的研究較少。本研究主要觀察NOV在AMML患者骨髓中的表達，探討NOV基因的表達與AMML患者預后的關系，以期為該類疾病預后的早期預測、治療提供思路。具示如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2015年1月至2018年12月本院收治的41例AMML患者為研究對象，所有患者均接受支持療法、化療等綜合療法干預，并隨訪17個月。其中男24例，女17例；年齡52～73歲，平均年齡(62.65±3.38)歲；體質量指數(Body Mass Index，BMI)17.5～26.36kg/m2，平均(23.40±1.21)kg/m2；合并基礎疾病：高血壓13例、糖尿病9例；白細胞3.2～65.8×109L-1，平均(25.66±5.21)×109L-1；中性粒細胞比例32～46%，平均(39.68±2.11)%。本研究通過本院醫學倫理委員會審核批準，且患者及家屬對本次研究知情，并簽署知情同意書。

1.2入選標準

1.2.1納入標準：①所有患者均符合《WHO(2008)造血與淋巴組織腫瘤分類》[5]中AMML的診斷標準，且經臨床表現(患者存在齒齦增生、腫脹、出血、壞死、出血等；且存在蛋白尿、皮膚白血病病損，腸壁潰瘍、浸潤等)、血象(血紅蛋白、紅細胞呈中度或者重度減少，血小板明顯減少，白細胞異常增高)、骨髓象(骨髓增生極度活躍或者明顯活躍，紅系細胞受抑制，巨核細胞及血小板明顯減少)等檢查確診；②患者均有不同程度的齒齦增生、腫脹、出血、腎衰竭、鼻黏膜浸潤、腸壁浸潤等表現；③依從性較好，可配合完成本次研究；④無精神疾病，且認知功能均正常者。

1.2.2排除標準：①合并心、肝、腎等重要臟器病變的患者；②合并惡性腫瘤的患者；③伴全身感染性疾病的患者；④合并凝血功能障礙或其他免疫系統疾病的患者；⑤具有穿刺部位放療史的患者。

1.3方 法

1.3.1化療方法：參照《血液病診療指南》[6]中標準對所有患者進行常規干預法及化療方案，常規干預法具體內容如下：根據患者情況加強護理，存在出血傾向的患者需臥床休息，維持水電解質平衡；根據患者貧血程度及血小板減少情況，及時輸注血小板及紅細胞，并給予常規營養支持及抗感染治療等。化療方案：給予患者持續2個周期的誘導化療：經標劑量化療方案，主要為皮下注射阿糖胞苷(Hospira Australia Pty Ltd，批準文號：H20160229，規格：1mg/0.1g)，12.5mg/次，1次/12h；靜脈滴注高三尖杉酯堿(四川寶鑒堂藥業有限公司，批號：20141203、20161210、20181103)，3mg/d，連續給藥7d為1周期。

1.3.2預后判斷及分組法：化療結束，參照《血液病診斷及療效標準(第3版)》[7]評價患者預后，其中完全緩解：原粒細胞Ⅰ型及Ⅱ型+原始及幼稚單核細胞≤5%；部分緩解：5%<原粒細胞Ⅰ型及Ⅱ型+原始及幼稚單核細胞≤20%；未緩解：原粒細胞Ⅰ型及Ⅱ型+原始及幼稚單核細胞>20%。將完全緩解、部分緩解患者納為預后良好組；將未緩解患者納為預后不良組。

1.3.3熒光定量聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)法：取所有患者化療前、化療1個周期、化療結束時骨髓組織標本，采用熒光定量PCR法測定NOV基因的信使RNA(mRNA)表達，步驟如下：將標本組織加入Trizol試劑(Sigma，美國)裂解細胞，加入0.2mL氯仿后，離心取無色水相上層，加入等體積的異丙醇，獲取樣本組織中總RNA，清洗干燥；利用紫外光吸收法測定總RNA濃度，并取2μL總RNA反轉錄為cDNA，PCR反應條件：第一步，循環94℃預變性5min，第二步，94℃變性30s、68℃逐漸下降至55℃退火30s(每個循環依次降低1℃)、72℃延伸30s，共12個循環；第三步，94℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共30個循環；最后，72℃延伸10min。結束后行瓊脂糖凝膠電泳，應用JS2380自動圖像凝膠分析儀(上海培清公司)，分析每條帶的光密度值，目的基因于內參照(GAPDH基因)比值為NOV基因mRNA的表達量。

1.3.4隨訪：全部患者均獲得隨訪，隨訪方式為門診、電話，隨訪時間為17個月，鞏固期間每個月復查1次骨髓，隨訪期間定期復查患者血常規及血涂片等。

2 結 果

2.141例AMML患者化療前、化療1個周期、化療結束時NOV基因表達情況：41例AMML患者化療前、化療1個周期、化療結束后的NOV基因mRNA表達量平均分別為(95.31±15.13)、(84.65±12.03)、(64.43±10.14)；化療1個周期、化療結束后，患者NOV基因mRNA的表達量較化療前明顯降低，且化療結束時表達量最低，差異有統計學意義(F=113.862，P<0.001)。(柱形圖見圖1)

圖1 41例AMML患者化療前、化療1個周期、化療結束時NOV基因表達的柱形圖

2.2預后及分組情況：41例AMML患者中，30例患者預后良好，占比73.17%(30/41)；11例患者預后不良，占比26.83%(11/41)。預后不良組患者性別、年齡、BMI、合并基礎疾病、白細胞及中性粒細胞比例基線資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同預后組患者基線資料比較

2.3不同預后組AMML患者骨髓NOV基因表達情況：化療1個周期、化療結束后兩組患者骨髓NOV基因表達均較化療前降低，且預后不良組患者各時點骨髓NOV基因表達均高于預后良好組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同預后組AMML患者骨髓NOV基因表達情況

2.4不同時間點NOV基因表達對AMML患者預后影響的Logistics回歸分析結果：將AMML患者預后作為因變量(1=預后不良，0=預后良好)，將不同時間點骨髓NOV基因表達作為協變量(均為連續變量)，進行Logistics回歸分析，在校正性別、年齡等資料之間的影響后，結果顯示，化療前、化療1個周期、化療結束時NOV基因表達均是AMML患者預后不良的影響因素(OR>1，P<0.05)。其中化療前NOV表達對AMML患者預后不良的影響最為明顯。相關參數見表3。

表3 不同時間點NOV基因表達對AMML患者預后影響的Logistics回歸分析結果

2.5化療前NOV基因表達預測AMML患者預后風險的價值分析：將化療前NOV基因表達作為檢驗變量，將AMML患者預后情況作為狀態變量；繪制ROC曲線結果顯示(見圖2)，化療前NOV基因mRNA的表達量預測AMML患者預后的AUC為0.879(95%CI：0.770～0.987，P<0.001)，有一定預測價值，且當最佳閾值取93.900時，可獲得較理想的診斷靈敏度與特異度，分別為：90.90%、70.10%，約登指數為0.610。

圖2 NOV基因表達預測AMML患者預后的價值ROC曲線圖

3 討 論

AMML病因尚未明確，目前治療該病的主要手段是化療，低危患者經聯合化療后可治愈，但仍有部分患者經綜合治療后效果不明顯，預后不佳，危及生命安全。研究[8]顯示，年齡、合并癥、基礎疾病、細胞遺傳學及分子生物學均可能是影響急性白血病預后的獨立危險因素。但經實踐發現，上述因素用于評估、預測AMML患者的預后還不準確，仍需探尋其他有效指標準確評估AMML患者的預后情況，以指導疾病的早期預防、診斷及治療。近年相關的研究[9]發現不少與白血病發病及預后相關的分子標志物，在一定程度上提高急性髓細胞白血病的診療水平。但尚未發現與AMML發生及預后相關的特異性分子標志物。

NOV基因屬于CCN家族成員，通過調節胰島素樣生長因子與其受體結合發揮作用，其編碼的蛋白質可以通過多種信號通路，參與多種細胞功能，如在細胞生長、分化及黏附等中發揮一定作用[10]。NOV是一類編碼細胞外分泌蛋白的基因，其編碼的CCN蛋白可通過其他信號分子互相作用，參與機體重要生命活動，如促進胎兒心血管系統發育，在成人體內還可影響血管形成及炎癥反應等[11]。目前關于NOV基因表達與急性白血病的關系研究甚少。2011年，一項動物實驗研究[12]顯示，NOV基因粒單核細胞白血病鼠中的表達明顯升高，其表達異常可能參與小鼠粒單核細胞白血病的發生、發展過程，且與療效具有一定聯系。由此可推測，NOV基因表達在AMML患者中也可能存在異常表達，且與疾病的預后具有一定聯系，但目前關于此類研究較少。

本研究以AMML患者為研究對象，分別在化療前、化療1個周期、化療結束后對NOV基因表達進行檢測，可較為全面反映NOV基因表達與AMML患者預后的關系。本研究結果顯示，化療1個周期、化療結束后，患者NOV基因mRNA的表達量較化療前明顯降低，且化療結束時表達量最低，提示化療對AMML患者NOV基因的表達具有一定影響；本研究還發現，預后良好組患者化療前、化療1個周期、化療結束后NOV基因mRNA的表達量均低于預后不良組，結果提示，AMML患者NOV基因mRNA的表達量越高，預后不良發生的風險越高，初步證實NOV基因mRNA的表達量與AMML患者的預后可能存在一定聯系；進一步做Logistics回歸分析結果顯示，化療前、化療1個周期、化療結束時NOV基因mRNA的表達量均是AMML患者預后不良的影響因素，其中化療前NOV基因mRNA表達量對AMML患者預后不良的影響最為明顯，提示NOV基因mRNA表達量與AMML患者預后不良有一定關系。分析其可能原因為，白血病的發病涉與原癌基因突變、抑癌基因功能缺失、促凋亡基因失活等分子機制有關[13]。而NOV基因在腫瘤的發生及發展中起到重要作用，且在不同腫瘤中表達存在一定差異，如NOV基因在前列腺癌、腎細胞癌、Ewing肉瘤等中表達增加，可促進腫瘤細胞增殖及轉移。但NOV在乳腺癌、黑色素瘤、尤文肉瘤、胰腺癌等中是抑癌基因，表達降低，可抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤分化，起到負調節作用。故而推測NOV基因mRNA的表達量與AMML患者的預后可能存在一定聯系。繪制ROC曲線結果顯示，化療前NOV基因mRNA的表達量預測AMML患者預后的AUC為0.879，有一定預測價值，提示化療前NOV基因高表達可能預示AMML患者預后不良發生高風險，考慮在未來可將AMML患者化療前NOV基因的表達作為預測患者預后的分子標志物。但導致這一結果發生的具體機制尚未明確，且尚無較多循證學依據可作為理論支持，加之本研究納入樣本量較少，結果可能存在一定偏差，研究仍有局限，仍需未來展開大樣本、多中心的研究加以驗證。

綜上所述，NOV基因高表達可能預示AMML患者預后不良高風險，化療期間檢測NOV基因表達狀況，可指導臨床早期預測、治療AMML患者。