重慶市HIV與NTM雙重感染患者的菌種分布及耐藥情況

劉敏 李明俊 余慶 何坤 吳玉珊 楊紅紅 李同心

非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)是指除結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌以外的一大類分枝桿菌的總稱。迄今為止，共發現NTM菌種190余種，14個亞種，其中大部分為寄生菌，僅少部分對人體致病，為條件致病菌[1-3]。近年來，NTM感染率呈快速上升趨勢，可引起肺部、皮膚、軟組織、骨關節、淋巴結等部位感染，尤其是對于免疫功能低下的人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染者，并發NTM感染率較高，且易被誤診為MTB感染。有研究顯示，在廣西、上海等地區HIV感染者的分枝桿菌培養陽性標本中約50%為NTM感染[4-6]。但不同地區由于自然環境及人群生活習慣等差異，導致HIV并發NTM感染的發生率不同，且NTM菌種分布及耐藥情況亦有所差異。為進一步了解重慶市HIV與NTM雙重感染患者的臨床特征及NTM的耐藥情況，本研究收集重慶市HIV與NTM雙重感染患者的臨床資料，分析NTM菌種構成及耐藥情況，以指導臨床合理診療。

對象和方法

一、研究對象

收集2019年6月至2020年6月在重慶市公共衛生醫療救治中心感染科明確診斷為HIV與NTM雙重感染的44例患者，占同期收治HIV并發所有分枝桿菌感染患者的23.8%(44/185)。HIV感染的診斷參考2018年中華醫學會感染病學分會艾滋病學組制定的《中國艾滋病診療指南(2018版)》[7]。NTM感染的診斷參考2019年《人類免疫缺陷病毒/艾滋病患者合并非結核分枝桿菌感染診治專家共識》[8]。

二、研究方法

回顧性收集所有研究對象的臨床資料(基本信息、臨床癥狀、檢測指標等)。計算NTM菌種的耐藥發生情況。分枝桿菌菌種鑒定檢測試劑盒由亞能生物技術(深圳)有限公司生產，可以鑒定22種分枝桿菌，分別為恥垢分枝桿菌、結核分枝桿菌復合群、次要分枝桿菌、胞內分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胃分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、瘰癘分枝桿菌、母牛分枝桿菌、龜分枝桿菌龜亞種、龜分枝桿菌膿腫亞種、蘇爾加分枝桿菌、海/潰瘍分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、迪氏分枝桿菌、偶發/豬分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、土分枝桿菌、草分枝桿菌、不產色分枝桿菌、戈登分枝桿菌。

NTM藥物敏感性(簡稱“藥敏”)試驗(微孔板)使用的試劑盒由珠海銀科醫學工程有限公司生產。操作方法：(1)取出凍干雜菌抑制劑和稀釋液，將稀釋液加入凍干粉，充分混勻。(2)取出液體藥敏培養基和藥敏測試板，恢復至室溫。吸取200 μl雜菌抑制劑加入液體藥敏培養基，充分混勻。(3)用一次性接種環挑取待測菌株新鮮菌落，移至專用比濁管，將比濁管放入自動超聲分散儀進行磨菌比濁至1 mg/ml，靜置5～10 min后取200 μl 1 mg/ml的均勻細菌上清至已加入雜菌抑制劑的液體藥敏培養基，充分混勻。(4)打開YK96自動移液平臺，將已加細菌的培養基、空白培養基和藥敏測試板放入平臺指定空位，運行“96孔”加樣模式。(5)待加樣完畢，蓋上微孔板蓋子，用膠條封閉板條空隙，置37 ℃生化孵育箱培養。(6)結果判斷：第3～7天觀察結果，孔底出現白色菌體沉淀的為陽性，無菌體沉淀的為陰性。陰性孔于第10天再觀察一次結果。最低抑菌濃度(MIC)為無白色沉淀的96微孔對應的最小藥物濃度。當難以判定MIC孔時，可將該孔與“1/10參照孔”作比較，如果該孔沉淀菌體小于“1/10參照孔”沉淀，即可判定生長被抑制。

三、統計學處理

結 果

一、一般情況及臨床特征

44例HIV與NTM雙重感染患者年齡范圍24～69歲，平均年齡(47.1±12.8)歲；其中19例(43.2%)有吸煙史，7例(15.9%)既往有肺結核病史。患者入院時主要臨床表現有咳嗽、咳痰、發熱、氣促癥狀，發熱以中低熱為主，見表1。分離出NTM的標本來源分別為：痰液38份(86.4%)、血液4份(9.1%)、腦脊液1份(2.3%)、淺表包塊分泌物1份(2.3%)、尿液1份(2.3%)，其中1例患者痰液及血液中均發現NTM。實驗室檢查發現44例患者中34例(77.3%)存在不同程度貧血，血紅蛋白中位數為101.0 g/L(正常值范圍：130～175 g/L)，白細胞及血小板均值均處于正常范圍(白細胞計數正常范圍：3.5×109/L～9.5×109/L，血小板計數正常范圍：125×109/L～350×109/L)，29例(65.9%)C反應蛋白(CRP)升高，中位數為32.3 mg/L(正常值范圍：0～10 mg/L)，CD4+T淋巴細胞計數44個/μl(正常值范圍：414～1123個/μl)，其中低于200個/μl 者40例(90.9%)。44例患者中9例(20.5%)初始治療方案給予抗NTM方案治療(方案中包含乙胺丁醇、利福布汀、左氧氟沙星、阿米卡星、阿奇霉素)，24例(54.5%)初始給予常規抗結核方案治療(異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、左氧氟沙星)，11例(25.0%)由于臨床癥狀輕，住院時間較短，出院時抗酸桿菌培養結果尚未報告，故住院期間未啟動抗分枝桿菌治療。后續隨訪過程中結合持續存在的臨床癥狀、實驗室檢查及影像學等指標綜合評估后，全部給予抗NTM治療。

表1 44例HIV與NTM雙重感染患者一般資料

二、NTM菌種鑒定結果

44株NTM菌株經PCR-反向點雜交法鑒定，共明確鑒定出8種NTM菌種，有2例菌株抗酸染色為陽性，超出本研究采用的菌種鑒定試劑盒鑒定范圍，未能明確鑒定出菌種。結果顯示，HIV感染者中鳥分枝桿菌占比最多(34.1%)，其次為胞內分枝桿菌(20.4%)，偶發/豬分枝桿菌及堪薩斯分枝桿菌各有5株(11.4%)，見表2。

表2 44株NTM菌種分布情況

三、NTM藥敏試驗結果

44株NTM菌株均完成表3中第1～8種藥物的藥敏試驗，其中21例患者同時完成第9～15種藥物的藥敏試驗，28例患者同時完成第16～22種藥物的藥敏試驗。結果顯示，44例患者NTM耐藥率高，對常用的抗結核藥物異煙肼、對氨基水楊酸異煙肼、利福平的耐藥率分別高達81.8%、75.0%、45.5%，對阿奇霉素耐藥率亦高達61.9%。耐藥率較低的藥物有利福布汀和克拉霉素，分別為6.8%和11.4%，氯法齊明、阿米卡星耐藥率也相對較低，但均接近30%。菌種分布中占比最高的鳥分枝桿菌耐藥形勢較為嚴峻，見表3。

表3 不同藥品在不同NTM菌株中的耐藥情況

討 論

HIV感染者免疫力低下，相較于非HIV感染人群，更容易感染NTM；在部分發達國家甚至超過了MTB感染率[9]。本研究中心為重慶市唯一一家集中收治艾滋病患者的三級傳染病專科醫院，研究結果具有一定的代表性。結果顯示，重慶市HIV感染者中分枝桿菌培養陽性標本NTM占23.8%，需臨床醫師高度警惕。本研究結果還顯示，HIV與NTM雙重感染患者臨床表現與MTB相似，缺乏特異性，且超過15%的患者既往有MTB感染史，臨床易被誤診為MTB，僅20.5%的患者初始治療方案給予抗NTM治療。故在選擇治療方案前需盡可能尋找病原學依據明確診斷，或者在抗結核試驗性治療過程中發現治療效果不佳時，亦需警惕是否為NTM感染。NTM可侵犯人體多部位多系統，本研究中15.9%的培養陽性結果來源于非痰液標本。故針對不同患者，應留取多部位標本，同時運用多種檢查方法(抗酸桿菌涂片、PCR、分枝桿菌培養)查找病原菌，而非局限于痰液標本，以提高培養陽性率。若同一例患者抗酸桿菌涂片陽性，而結核DNA或RNA檢測顯示陰性時，亦需警惕是否為NTM感染。

鳥分枝桿菌是HIV與NTM雙重感染患者NTM感染菌株中最常見的菌種[10]。上海、廣西等地HIV與NTM雙重感染患者中鳥分枝桿菌占比為43.3%～54.0%[4-5]。本研究結果顯示，重慶市NTM感染患者中鳥分枝桿菌亦為最常見菌種(34.1%)，占比低于上海、廣西等地[4-6]，高于非洲西部地區(23.7%)[11]，考慮與氣候環境等因素相關。張匯征等[12]2019年進行的研究顯示，重慶市非HIV感染人群并發NTM感染菌株中以膿腫分枝桿菌為主(39.5%)，其次為胞內分枝桿菌(34.9%)，而鳥分枝桿菌僅占7.0%。可見，不同特征人群NTM檢出率存在差異，且檢出的NTM菌種構成比亦有明顯差異，考慮系人群免疫功能差異所致。

NTM耐藥率極高，大多數NTM感染者對抗結核藥物具有天然耐藥性[13]。賈彤等[14]研究顯示，較常見的NTM對常用的一線抗結核藥物如異煙肼、利福平普遍耐藥，耐藥率近100%。秦中華等[15]的研究顯示，NTM對二線抗結核藥物如卡那霉素、氧氟沙星的耐藥率亦分別高達80.6%和68.1%。有研究顯示，HIV與NTM雙重感染患者病死率高達29%[16-17]。本研究顯示，重慶市HIV與NTM雙重感染患者對異煙肼、對氨基水楊酸異煙肼、阿奇霉素、利福平的總體耐藥率分別高達81.8%、75.0%、61.9%、45.5%，可供選擇藥物種類有限。耐藥率相對較低的藥物有利福布汀、克拉霉素，其次為丙硫異煙胺、氯法齊明、阿米卡星。需特別指出的是，本結果顯示HIV并發鳥分枝桿菌感染者對丙硫異煙胺的耐藥率高達100%，該結果有別于廣東地區HIV并發鳥分枝桿菌感染對丙硫異煙胺的耐藥率(7.1%)[14]，亦有別于重慶市非HIV感染者出現鳥分枝桿菌感染時對丙硫異煙胺的耐藥率(33.2%)[13]。因此，對于HIV與NTM雙重感染患者，有必要行NTM菌種鑒定及耐藥檢測，以便指導下一步治療，不能簡單套用不同省市、不同特征人群NTM藥敏試驗結果選擇治療方案。針對無法行菌種鑒定及耐藥檢測的醫療機構，可參考當地相同特征人群的NTM耐藥報告給予經驗性治療，治療過程中注意抗NTM藥物與抗HIV藥物間的相互作用。

總之，由于HIV感染者免疫功能低下，易并發NTM感染，以鳥分枝桿菌及胞內分枝桿菌為主。該群體NTM耐藥形勢嚴峻，在診療過程中需高度警惕，對HIV感染者進行準確的分枝桿菌菌種鑒定及藥敏試驗對臨床診治具有重要意義。本研究分析亦存在不足，如44例NTM感染患者并非全部完成22種藥物的藥敏試驗，且總體樣本量偏少，有待收集更大樣本更深入地明確重慶市HIV與NTM雙重感染的現狀及療效。