山東地區439株非結核分枝桿菌臨床分離株菌種鑒定及耐藥情況

封彬彬 金鋒 景輝 王俊玲 林美英 喬秀麗 李銘 邱麗華

非結核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)在自然界中廣泛分布，已知190余種[1]，人和動物均可感染，主要引起肺部病變等。我國NTM肺病的發生率呈明顯上升趨勢[2]，危害性日益凸顯。NTM肺病的臨床癥狀、影像學表現與肺結核相似，但治療方案明顯不同，極易誤診誤治，遷延不愈[3]。為此，筆者回顧性分析山東地區NTM肺病患者臨床分離株的菌種分布及耐藥情況，為早期診斷及治療NTM肺病提供依據。

材料和方法

1.菌株來源：收集2015年1月至2019年12月山東省胸科醫院收治的經BACTEC MGIT 960培養陽性的疑似肺結核患者臨床分離株，共計3783株，其中，439株鑒定為NTM，對可繼續分型檢測的354株NTM菌株進行菌種鑒定和耐藥檢測。354株NTM菌株分離自354例NTM肺病患者，其中，男230例(64.97%)，女124例(35.03%)；年齡范圍為11～90歲，年齡中位數(四分位數)為60(50，66)歲；分離標本包括支氣管毛刷物標本29份、肺泡灌洗液標本8份、痰液和(或)胸腔積液標本共計317份。

2.菌種鑒定：(1)初步菌種鑒定：按照《結核病實驗室檢驗規程》[4]對BACTEC MGIT 960培養陽性菌株進行早期分泌蛋白(MPB64)抗原膠體金方法檢測，陰性為NTM。(2)DNA微陣列芯片法菌種鑒定：嚴格按照說明書進行操作。以試劑盒自帶的陰性和陽性對照作為質控，依次進行核酸提取、PCR擴增、芯片雜交、芯片洗滌和干燥、芯片掃描和結果判讀。可檢測臨床常見的17種分枝桿菌，包括結核分枝桿菌復合群、胞內分枝桿菌、鳥分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、龜分枝桿菌等。(3)質譜菌種鑒定：采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)微生物鑒定系統對上述17種之外的分枝桿菌進行鑒定。

3.藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)：(1)羅氏培養基絕對濃度法(2018年前)。檢測的10種藥品及其濃度分別為：異煙肼：1、10 μg/ml，利福平：50、250 μg/ml，乙胺丁醇：5、50 μg/ml，鏈霉素：10、100 μg/ml，氧氟沙星：25、100 μg/ml，左氧氟沙星：1、10 μg/ml，卷曲霉素：10、100 μg/ml，卡那霉素：10、100 μg/ml，阿米卡星：10、100 μg/ml，對氨基水揚酸：1、10 μg/ml。當含藥培養基上生長的菌落數≥20個即判定為耐藥(包括高濃度耐藥和低濃度耐藥)。(2)液基微孔板法(2018年及以后)。對選取的NTM菌株進行15種藥品的藥敏試驗，應用細菌超聲分散計數儀進行細菌的超聲比濁定量，按照藥敏檢測試劑盒(微孔板法)說明書進行操作判讀。不同藥品及最低抑菌濃度(MIC)分別為：利奈唑胺≥32 μg/ml；克拉霉素≥16 μg/ml；利福平≥6 μg/ml；阿米卡星≥64 μg/ml；亞胺培南≥16 μg/ml；乙胺丁醇≥5 μg/ml；頭孢西丁≥80 μg/ml；阿奇霉素≥16 μg/ml；利福布汀≥2 μg/ml；妥布霉素≥6 μg/ml；加替沙星≥1 μg/ml；莫西沙星≥8 μg/ml；多西環素≥8 μg/ml；米諾環素≥8 μg/ml；復方磺胺甲噁唑≥80 μg/ml。

4.統計學處理：采用Excel 2016和SPSS 19.0軟件對數據進行整理和統計學分析。計數資料采用“構成比或百分率(%)”表示，組間差異的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.菌種鑒定：354株NTM菌株共鑒定出12種菌種，主要以胞內分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌及膿腫分枝桿菌為主(表1)。

表1 2015—2019年山東地區354株非結核分枝桿菌臨床分離株的菌種分布

2.各患者年齡及性別分布：NTM臨床分離株各菌種在不同性別及年齡患者中分布差異均有統計學意義，其中，胞內分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌以男性感染為主，膿腫分枝桿菌以女性感染為主；中老年(≥45歲)感染者占84.75%(300/354)，見表2。

表2 不同性別和年齡非結核分枝桿菌肺病患者感染菌種的分布情況

3.藥敏試驗結果：354株NTM菌株中有183株行藥敏試驗，其中，50株采用絕對濃度法檢測，結果顯示：除對乙胺丁醇的耐藥率為52.00%外，對其余9種藥品的耐藥率均高于86.00%(表3)。133株采用微孔板法進行藥敏試驗，結果顯示：不同NTM菌種對阿米卡星及克拉霉素的耐藥率均低于10.00%，而對莫西沙星均敏感；對亞胺培南/西司他丁、多西環素、米諾環素、復方磺胺甲噁唑的耐藥率均較高。同時對利奈唑胺、利福平、乙胺丁醇、頭孢西丁等9種藥品的耐藥率存在種間差異(表4)。

表3 采用絕對濃度法檢測不同藥品對50株不同菌種NTM菌株的耐藥情況

表4 采用微孔板法藥敏試驗檢測不同藥品對133株不同菌種NTM菌株的耐藥情況

討 論

隨著人口老齡化、免疫抑制人群的增多，以及長期服用抗生素可能為NTM提供了良好的生長繁殖環境[5]；加之實驗室檢測水平的提高，NTM的發病率和患病率在一些國家和地區呈上升趨勢，甚至超過了結核病[6]。NTM菌種豐富，治療方案也各不相同，且大部分對抗結核藥物具有天然耐藥性，臨床診斷治療面臨極大困難。因此，了解本地區NTM菌種分布和及早進行藥敏試驗對NTM肺病的正確診斷及有效治療意義重大。

NTM菌種分布具有明顯的地域差異，如全球范圍和呼吸道的NTM分離株中鳥分枝桿菌復合群的分離率最高，也是臨床相關性最強的菌種[7-8]。但我國的NTM主要以胞內分枝桿菌和膿腫分枝桿菌為主，且分別是東部和南部地區的主要致病菌株[9]。本次調查共檢出12種NTM菌種，胞內分枝桿菌的占比最高(69.77%)，與對中國東部(68.33%)的研究基本一致[10]，但高于北京地區(39.2%)[11]；其次是堪薩斯分枝桿菌(12.71%)，明顯低于北京地區(37.7%)[11]和上海地區(45.0%)[12]；而鳥分枝桿菌復合群的檢出率很低，僅為1.41%。可能與地域性差異、臨床分離株數量少或相關調查時間差距較大有關。

既往研究發現，年齡和性別是NTM致病的主要危險因素，NTM的發病率隨年齡的增高而逐步上升[11,13-14]，而與結核病、糖尿病及慢性阻塞性肺疾病等無關[15]。本研究中，男性患者多于女性，45歲及以上患者達84.75%，與華東地區[16]和北京地區[11]的報道情況基本一致。這可能與男性吸煙較多易誘發呼吸道疾病，以及中老年人群免疫力降低，或既往感染后定植于呼吸道而未發病有關[17]。但也有研究認為，NTM肺病是慢性病，可發生于任何年齡，且女性患病率明顯高于男性，尤其是絕經期婦女較為常見[5-6,18]，僅與本研究中膿腫分枝桿菌的性別分布結果一致。筆者認為與所處地區、納入患者種類及數量大小有關。

NTM的細胞壁具有高疏水性和透過率，藥物不易蓄積，致藥物作用濃度較低，極易產生耐藥或耐多藥[11,19]。本研究采用絕對濃度法對50株NTM行10種抗結核藥品的耐藥性檢測，發現除對乙胺丁醇的耐藥率偏低(52.00%)外，對其他9種藥品的耐藥率均≥86.00%，與沈瑤杰等[20]報道的“大多數NTM對傳統抗結核藥物的活性均很低或沒有”的結論基本一致。考慮與其能阻礙NTM細胞壁的合成有關[21]。但本次調查發現，NTM對阿米卡星的耐藥率(96.00%)相對較高，不同于其他研究顯示的阿米卡星對鳥分枝桿菌和龜-膿腫分枝桿菌等有較強的抗菌活性結論[22-23]，也與《非結核分枝桿菌病診斷與治療指南(2020年版)》[21]中指出的多數NTM菌株對阿米卡星敏感。阿米卡星是治療NTM肺病常用且有效藥品的理論相悖，考慮可能與該藥近年來在臨床中已被廣泛應用有關，應對患者的用藥進行跟蹤隨訪。絕對濃度法檢測結果的高耐藥性說明對NTM僅進行一、二線抗結核藥物的耐藥性分析不能很好地指導臨床用藥，應積極進行其他藥物的耐藥性檢測。

微孔板法藥敏試驗是近年來發展出來的新技術，可以同時獲得較為詳細的多種抗生素的耐藥數據和簡明的耐藥值及MIC值的判斷，具有較高的符合率及特異度。筆者所在醫院于2018年開始采用NTM微孔板藥敏試驗檢測試劑盒(含15種藥品)，本次調查中133株NTM菌株采用此法檢測，結果發現菌株總體對莫西沙星、阿米卡星和克拉霉素的敏感性較高，且對不同NTM菌種的體外活性均表現較強，與既往的研究結果一致[24-25]，并有長期口服莫西沙星治愈膿腫分枝桿菌肺病患者的病例報道[26]。可能與藥品進入菌體的方式、脂溶性的大小、菌體表面有無外排泵等性質有關，也可能與莫西沙星不經細胞色素P450酶代謝，減少了藥物間相互作用的可能性，在與其他抗生素聯合使用時降低了耐藥的發生率有關。因此，筆者認為莫西沙星口服方便，吸收利用度高，患者依從性好，當沒有藥敏試驗結果時，莫西沙星、阿米卡星和克拉霉素可以作為臨床治療NTM肺病的優選抗生素，即使體外藥敏試驗為耐藥，也應與克拉霉素或其他抗生素聯合使用，對臨床治療是一種較好的選擇[27]。另一方面，不同NTM菌種的耐藥種類和耐藥率也不同。本研究顯示，胞內分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、膿腫分枝桿菌對利奈唑胺、利福平、乙胺丁醇、頭孢西丁等藥品的耐藥率的差異均有統計學意義。因此，建議臨床用藥前應盡量進行菌種鑒定和藥敏試驗以指導科學用藥。