COX-2、VEGF、Galectin-3 在子宮腺肌病中的表達及其與臨床癥狀的相關性研究

梁爽，劉歡歡，王婷婷,石路瑩,李燦宇

（鄭州大學第三附屬醫院 婦科，河南 鄭州 450052）

0 引言

子宮腺肌病（Adenomyosis,AM）是指子宮內膜腺體及間質侵入子宮肌層，異位的子宮內膜組織刺激局部炎癥反應，導致周圍肌纖維肥大和增生，形成彌漫性病變或局灶性病變的疾病[1]。絕大多數患者會有進行性加重的痛經、月經量增多、子宮增大，繼而引發不孕等癥狀，嚴重影響婦女的健康及生活質量[2]。有研究表明，AM 患者痛經的發生率為30.0%～77.8%，并且呈逐年上升，發病年齡以40 歲以上經產婦多見[3]。目前AM 的病因及發病機制不清，但文獻報道血管生成在AM 內膜異位定植、侵襲及異常增殖發揮重要的作用[4]。其中環氧合酶-2( cyclooxgenase -2，COX-2)、血管生成因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）促進子宮內膜血管的形成[5,6]。半乳糖凝集素-3（Galectin-3）在疾病形成過程中與細胞的增殖、血管的生成有直接或間接的關系[7]。本研究檢測了AM 患者血清、組織中COX-2、VEGF、Galectin-3 蛋白的表達，旨在探究各因子在AM 發生、發展中的作用及其與臨床特征的關系，同時也為疾病的治療提供相應的理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年8 月至2017 年4 月在鄭州大學第三附屬醫院因子宮腺肌病行手術治療并經病理證實的子宮腺肌病患者38 例作為病例組，分別取其在位、異位內膜組織用于研究，選擇同時期因子宮肌瘤行腹腔鏡下子宮全切術手術治療且術后排除子宮腺肌病和子宮內膜異位癥的患者40 例為對照組，病例組年齡23～42 歲，平均（34.2±4.4）歲，對照組年齡23～42歲， 平均（31.9±5.7）歲。納入標準：育齡期女性，月經周期規律，術前3 個月內無激素類藥物應用史。 排除標準：長期用藥史，合并內分泌疾病、惡性腫瘤、免疫系統疾病等病史，合并高血壓、糖尿病等慢性病史，合并卵巢囊腫、子宮內膜異位癥等雌激素依賴性子宮內膜相關性疾病病史。本研究經醫學倫理委員會審批通過，并且經患者知情同意。

1.2 材料與方法

血清標本：所有患者在術前清晨空腹留取其外周靜脈血4mL 注入一次性試管中，全血樣品樣品經離心機10000r/min離心20min，然后將血清吸取放置在1.5mL 的EP 管內，密封放置在-80℃冰箱中保存待測。標本的收集及應用過程中應注意避免反復的凍融。

組織標本：術中取AM 患者異位、在位內膜組織及對照組正常子宮在位內膜組織立即放入10%的中性緩沖福爾馬林中固定24h，然后至我院病理科進行脫水、包埋形成蠟塊常溫保存待測。切片的厚度約3mm。

1.3 ELASA 檢測

血清中COX-2、 VEGF、 Galectin-3 的測定使用人 ELISA試劑盒（購自武漢伊萊瑞特生物技術股份有限公司），實驗操作流程嚴格按照說明書中步驟進行，同時設置空白對照孔及復孔。采用波長450nm 測量每孔吸光度，根據標準曲線的結果計算出各因子的表達水平。

1.4 免疫組化檢測

采用免疫組織化學SP 法測定AM 異位、在位內膜組織與對照組內膜組織中COX-2、VEGF、Galectin-3 的表達情況。實驗過程嚴格按照免疫組化試劑盒中提供的說明書進行，預實驗先確定各因子的工作濃度（稀釋后的一抗）：COX-2（1:50）、VEGF( 1: 100)、Galectin-3( 1:50) 。

1.5 免疫組化結果判定

用低倍和高倍鏡觀察切片，陽性細胞為鏡下組織細胞結構清晰，細胞漿或細胞核內有棕黃色顆粒沉著，染色明顯高于背景。VEGF 陽性部位位于胞漿、COX-2 陽性部位位于包膜和胞漿、Galectin-3 陽性部位位于胞漿。免疫組化結果由兩位實驗人員獨立進行定量評分，在細胞密集區隨機選取五個高倍視野，計數300 個細胞。先計算出陽性染色細胞的百分數(陽性率)同時評分，小于5%計為0 分，5%-25%計為1 分，26%-50%計為2 分，51%-75%計為3 分，大于75%計為4 分；染色強度判斷：0 分為無著色，1 分為淺棕黃色，2 分為棕黃色，3 分為棕褐色。免疫組化結果判斷釆用雙盲法。結果以半定量評分表示，每個標本按染色強度和陽性細胞百分比的乘積計算。最后將陽性率評分與強度評分相乘所得之積即為該組織的免疫組化最終評分。最終根據兩者的乘積將染色情況分為4 級，0 分為陰性（-）、1-4 分為弱陽性（+）、5-8 分為陽性（++）、9-12 分為強陽性（+++）。

1.6 痛經、子宮大小及月經量評估

所有納入標準的患者，采用VAS 法對患者進行疼痛評分。在VAS 卡中心刻有數字的10cm 長線上有可滑動的游標，兩端分別表示“無痛”(0)和“最劇烈的疼痛”(10)。患者面對無刻度的一面，患者將游標移至當時最能代表疼痛程度的部位；醫生面對有刻度的一面，并記錄疼痛程度。疼痛評分：無痛記為0 分，輕度疼痛(1-4cm)記為1 分，中度疼痛(5-7cm)記為2 分，重度疼痛(8-10)記為3 分。子宮大小的改變以三個徑線的乘積為子宮體積的計算量進行統計，有專人應用陰道彩超測量子宮體積：大于350cm3為子宮增大[8,9]。按月經失血圖（PBAC）[10]對月經量評分。方法收集患者使用完畢后的每張衛生巾，根據月經失血圖每張衛生巾的血染程度分為：輕度，血染面積占衛生巾的1/3 及以下，計1 分；中度，血染面積占衛生巾的1/3-3/5，計5 分；重度，血染面積基本為整個衛生巾，計20 分。遺失血塊大小小于1 元硬幣，屬小血塊，計1 分；大于等于1 元硬幣，屬大血塊，計5 分。評估整個經期的月經量。評分＞100 分月經量≥80mL。

2 統計學方法

采用SPSS 21.0 統計軟件分析數據，計量資料采用獨立樣本t檢驗及均數±標準差（±s）表達；采用確切概率法(Fisher's exact test)分析AM 組與對照組患者的一般臨床特征，及COX-2、VEGF、 Galectin-3 表達與AM 患者痛經、月經量的關系，P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 AM 組與對照組臨床特征的關系

如表1 所示：AM 組與對照組患者的子宮大小、月經量、痛經之間的關系差異具有統計學意義（P＜0.05）,兩組患者的年齡差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 AM 組與對照組患者的一般臨床特征

3.2 免疫組化檢測

兩組內膜組織中COX-2、VEGF、Galectin-3 蛋白的表達（圖1）如表2 所示：AM 患者異位內膜組織中COX-2、VEGF、Galectin-3 表達均高于在位內膜組織，差異具有統計學意義（P＜0.05），但AM 患者在位內膜組織中COX-2、VEGF、Galectin-3 表達與對照組在位內膜相比，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

3.3 ELASA 檢 測AM 組、對照組 COX-2、VEGF、Galectin-3 蛋白的相對表達

AM 組血清中COX-2、VEGF、Galectin-3 的表達均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）（見表3）。

3.4 AM 組異位、在位內膜組織中COX-2、VEGF、Galectin-3 蛋白的表達與痛經、月經量的關系

對照組中患者無明顯月經量增多及痛經，因此本研究僅統計AM 組各因子與痛經及月經量的關系。AM組中COX-2 的表達與痛經相關，差異具有統計學意義（χ2=9.797，P＜0.05），VEGF、Galectin-3 的表達與痛經無顯著相關（χ2=3.697P=0.083，χ2=0.522，P=0.650）；AM 組中COX-2、VEGF、Galectin-3 的表達與月經量無顯著相關（χ2=0.026，P=1.000,χ2=0.317，P=0.709,χ2=0.110P=1.000），見表4。

圖1 免疫組化檢測COX-2、VEGF、Galectin-3 蛋白在內膜組織中的表達（SP,×100)

表2 AM 組、對照組在位、異位內膜COX-2、VEGF、Galectin-3 蛋白的表達

表3 AM 組與對照組血清中COX-2、VEGF、Galectin-3 的表達

表4 AM 組COX-2、VEGF、Galectin-3 的表達與痛經、月經量的關系

4 討論

子宮內膜異位癥是指子宮內膜腺體和間質出現在子宮體以外的部位,AM 卻是指子宮內膜腺體和間質在子宮肌層彌漫性或局限性生長。二者雖發病機制不完全一致，但卻有共同的臨床特點：如兩者雖為良性疾病，卻均具有惡性腫瘤的一些特征，如血管生成、局部或遠處的浸潤、生長等。子宮內膜異位癥和AM 的發病機制目前尚未明確，Sampson 提出的“經血逆流”學說一直是子宮內膜異位癥經典的發病理論，脫落的子宮內膜伴隨經血通過輸卵管逆流并種植于盆腔，形成子宮內膜異位癥。而這一理論不能完全解釋腺肌病，于是，很多學者認為子宮內膜異位癥和AM 是兩種完全不同的疾病。AM 通常用子宮基底層內膜內陷學說來解釋，多次妊娠及分娩、人工流產、慢性子宮內膜炎等造成子宮內膜基底損傷，內膜基底層缺乏粘膜下層保護，子宮內膜易“侵入遷延”至肌層。近年來，隨著分子生物學的發展，對AM 發病機制的研究也不斷進展，血管生成、細胞因子、炎性介質、上皮-間質細胞轉化、甾體激素的作用等可能參與了AM 的發生、發展過程，對AM 發病機制的研究有望為臨床診斷和治療提供新思路[11,12]。

AM 是一種雌激素依賴性疾病，COX-2 是花生四烯酸合成前列腺素（PGs）的主要限速酶，AM 患者中COX-2 通過促進PGs 的合成增加，激活更多的芳香化酶（P450arom）促進雌二醇（E2）合成增加，E2 與P450arom 之間存在一個惡性的正反饋循環[13,14]。PGs 主要為PGE2 和前列腺素F2a(PGF2a),均可以引起痛經，PGF2a 能刺激血管強烈的收縮，PGF2a 作用于PGF2a 受體（PTGFR）引起子宮平滑肌收縮過強，血管痙攣，導致子宮局部組織缺血缺氧而出現痛經[15]。AM 患者中致痛因子作用于外周神經，造成相應的感受器數量和神經纖維密度增加，造成痛覺敏化提高傷害感受器的敏感性，導致痛覺過敏[16,17]。本研究發現，在AM 組中COX-2 的表達與痛經的關系具有統計學意義,提示AM 組中COX-2 過表達促進疼痛因子PGs 合成增加，引發痛經，嚴重痛經會影響婦女的生活質量。本課題組的前期研究增提示沉默COX-2 因子，會導致子宮腺肌病間質細胞中的VEGF，MMP-9mRNA 和蛋白表達下調。因此，COX-2 可能是子宮腺肌病發病及痛經的主要作用靶點和始動因素。COX-2 有望成為治療子宮腺肌病患者痛經的重要分子靶點。

VEGF 是促進血管生成的關鍵因子，能夠促進內皮細胞分裂、刺激新生血管生成、提高血管的通透性、改變細胞外基質促進血管內皮細胞的遷移等[18]。研究表明[19]VEGF 高表達與AM 發病機制有關，促進異位病灶血管的形成。Galectin-3 屬于半乳糖凝集素家族，主要參與細胞的增殖、分化、凋亡，介導細胞間黏附和免疫調節等多種作用，近年來發現，Galectin-3與炎癥反應、新生血管的形成及腫瘤的浸潤轉移等有關[20,21]。本研究結果顯示COX-2、VEGF、Galectin-3 在AM 患者血清、異位內膜組織中的表達均高于對照組，提示三因子可能參與AM 的發生。本研究中COX-2、VEGF、Galectin-3 在AM 在位內膜組織中的表達與對照組無統計學意義，但血液中表達高于對照組，提示AM 的發生除了局部內膜的異位侵襲起作用外，全身性其他的因素（如免疫因素）可能也參與AM 的發生、發展。

AM 患者子宮肌層呈彌漫性生長，肌層纖維增生影響子宮收縮，且常合并子宮內膜增生，導致月經量過多[22]。AM患者子宮內膜表層血管生成活躍，異位病灶中血管生成及毛細血管數量在增殖期和分泌期都明顯增加，這些變化可能會促進異位病灶的活性，從而導致子宮增大、月經量增多[23,24]。COX-2、VEGF、Galectin-3 均參與新生血管的形成，而本研究中COX-2、VEGF、Galectin-3 在AM 組子宮異位內膜中的表達均與月經量無明顯相關性，提示COX-2、VEGF、Galectin-3可能在疾病的早期參與AM 的發生，而AM 患者月經量增多則為子宮腺肌病進展到一定程度后發生的晚期事件，因此三者的表達與AM 月經量無顯著相關。

綜上所述，AM 的發病機制仍尚不明確，COX-2、VEGF、Galectin-3 可能參與AM 的發生。COX-2 過表達是導致痛經的重要因素之一，有望成為治療痛經的分子靶點。但本研究收集的樣本量較少，其與AM 的關系有待于采取前瞻性進一步大樣本研究。