1例豬鏈球菌5型感染者分離菌的病原學(xué)診斷、分型及相關(guān)基因的檢測(cè)

李曲文,羅宏活，黃夢(mèng)穎，謝芳?xì)J，林震宇，徐海濱，翁順太

豬鏈球菌最早見于荷蘭 (1951)和英國(guó)(1954)報(bào)道，是一種能引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi) 膜炎、敗血癥和肺炎的病原菌，并可以引起人的感染，是一種呈世界廣泛分布的人獸共患病[1]。 豬鏈球菌根據(jù)莢膜多糖抗原的不同共分為33個(gè)血清型。在豬和人體以豬鏈球菌血清型2型最常被分離到且是致病力最強(qiáng)，不同的血清型也不斷的被發(fā)現(xiàn)可以引起人的感染，如血清1/2 、7 、9 、14，31 等也能引起人豬鏈球菌感染[2]。本文通過實(shí)驗(yàn)室診斷對(duì)1例豬鏈球菌5型的病例進(jìn)行診斷及分子分型分析，闡述如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 菌株分離來自福建三明鄧某某血液培養(yǎng)分離菌株。

1.2主要試劑和儀器 血平板、VITEK2全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)、GP卡、革蘭染色液購(gòu)自廣東環(huán)凱公司，α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)(HCCA)購(gòu)自德國(guó) Bruker 公司，甲酸、乙腈和三氟乙酸購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。 分子生物學(xué)試劑購(gòu)自TaKaRa寶生物工程有限公司，引物序列及測(cè)序均由鉑尚生物技術(shù)有限公司完成，MALDI-TOF MS -Microflex TM LT 型(德國(guó)Bruker公司)。

1.3方法 通過血培養(yǎng)分離可疑菌株，并對(duì)分離菌株進(jìn)行涂片革蘭染色鏡檢及常規(guī)的生化鑒定以及常規(guī)PCR鑒定豬鏈球菌屬基因(16SrRNA)、豬鏈球菌33(1～31型,33型,1/2型)種血清型基因鑒定；豬鏈球菌毒力相關(guān)的谷氨酸脫氫酶(gdh)、溶菌酶釋放蛋白(mrp)、胞外因子(ef)、溶血素(sly)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (gapdh)、纖連蛋白/血纖蛋白原結(jié)合蛋白(fbps)及毒力相關(guān)序列(orf2)等基因、質(zhì)譜鑒定等等。MLST分型用PCR擴(kuò)增aroA、cpn60、dpr、gki、mutS、recA、thrA，PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳后測(cè)序。序列經(jīng)提交MLST網(wǎng)站(http://pubmlst.org/ssuis/)，確定序列分型(SequenceType,ST)型別，各基因引物序列見表1、表2，參考文獻(xiàn)[3-5]。

表1 豬鏈球菌基因檢測(cè)引物Tab.1 Primers for gene detection of Streptococcus suis

表2 7個(gè)管家基因引物Tab.2 Primers for seven housekeeping genes

2 結(jié) 果

2.1革蘭染色結(jié)果 革蘭陽性球菌

2.2生化鑒定 VITEK2 GP 卡，89%為豬鏈球菌1型/87%豬鏈球菌2型。

2.3基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MALDI-TOF- MS)鑒定結(jié)果：鑒定分值 (ScoreValue)為2.03(極好的鑒定為豬鏈球菌)。質(zhì)譜峰圖見圖1。

圖1 質(zhì)譜峰形圖 Fig.1 Peak shapes of the mass spectrum

2.4藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對(duì)氨芐西林、氨芐青霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、利奈唑胺、萬古霉素、替加環(huán)素等抗生素體外藥敏實(shí)驗(yàn)均為敏感；而對(duì)氯霉素和四環(huán)素兩種藥物顯示為耐藥。

M:DL2000;1.16S rRNA；2.cps5；3.ef；4.mrp；5.sly；6.gdh；7.gapdh；8.fbps；9.orf2圖2 豬鏈球菌的檢測(cè)電泳圖Fig.2 Electropherogram of Streptococcus suis detection

2.5豬鏈球菌相關(guān)基因及毒力基因鑒定結(jié)果 菌株豬鏈球菌相關(guān)基因鑒定結(jié)果：16SrRNA(+)cps5(+)，并經(jīng)與NCBI上豬鏈球菌Cps5序列比對(duì)與strain:11538序列100%相似。提示該菌株為豬鏈球菌血清型5型；毒力基因攜帶模式：ef(-)mrp(+)sly(+)gdh(+)gapdh(+)fbps(-)orf2(-)。電泳結(jié)果見圖2、3。

圖3 Cps5序列比對(duì)結(jié)果Fig.3 Cps5 sequence alignment results

2.6MLST結(jié)果aroA-cpn60-dpr-gki-mutS-recA-thrA基因等位基因譜為8-30-5-45-44-22-109，經(jīng)比對(duì)序列分型，型別為ST373。7個(gè)基因電泳結(jié)果見圖4。

M:DL2000;1：aroA;2：cpn60;3：dpr;4：gki;5：mutS;6：recA;7：thrA圖4 MLST電泳圖Fig.4 Electropherogram of MLST

3 討 論

豬鏈球菌是一種可以從豬傳染人的病原體，主要通過皮膚傷口感染。雖然豬鏈球菌有33個(gè)血清型，但并不是所有的血清型都能引起人的感染，2型是最常見的致病血清型，也是我國(guó)主要的流行菌株，但其他血清型如1，1/2，7，9，31等均有陸續(xù)的報(bào)道人感染豬鏈球菌[6-8]。對(duì)菌株的快速、準(zhǔn)確鑒定以及相關(guān)的分子診斷分析對(duì)于疫情處置和臨床診療具有重要的臨床意義。

如何快速的對(duì)分離株的鑒定是實(shí)驗(yàn)室首要任務(wù)，通過傳統(tǒng)的細(xì)菌常規(guī)分離培養(yǎng)、生化鑒定該菌株為陽性鏈球菌，VITEK 2-compact分析系統(tǒng)是近年來由梅里埃研發(fā)的可簡(jiǎn)便、快速鑒定豬鏈球菌的一種方法。本文中分離到的菌株通過VITEK 2-GP生化鑒定提示89%為豬鏈球菌1型/87%豬鏈球菌2型，為進(jìn)一步驗(yàn)證鑒定結(jié)果，經(jīng)MALDI-TOF- MS質(zhì)譜鑒定其鑒定分值為2.03，極好的鑒定結(jié)果判定為豬鏈球菌屬。為進(jìn)一步了解菌株所屬的血清基因型別，因血清凝集實(shí)驗(yàn)經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)血清交叉凝集現(xiàn)象，故而本實(shí)驗(yàn)直接經(jīng)常規(guī)PCR進(jìn)行豬鏈球菌屬基因(16SrRNA)及以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的莢膜分型糖(CPS)對(duì)豬鏈球菌的33(1～31型,33型,1/2型)種血清型基因分型結(jié)果為16SrRNA陽性、CPS5陽性，判斷為豬鏈球菌血清型5。

為了解福建省首次分離到的這一株豬鏈球菌5型病例菌株的致病性，分析了ef、mrp、sly、gdh、gapdh、fbps、orf2等毒力基因。由于不同的毒力基因編碼的蛋白具有不同的功能，mrp基因是編碼胞外因子的有助于細(xì)菌突破血腦屏障，而ef是一種粘附素，能黏附上皮細(xì)胞并誘導(dǎo)上皮細(xì)胞融合和凋亡，MRP和EF是判斷豬鏈球菌其毒力強(qiáng)弱的重要毒力因子，本次分離到的菌株為mrp+/ef-/,表明該菌株為弱毒株；sly基因編碼的溶血素是具有溶血活性且可破壞微血管內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞，有利于細(xì)菌在組織中的侵襲擴(kuò)散，同時(shí)谷氨酸脫氫酶(GDH)是細(xì)菌能量代謝的一個(gè)重要分子，也是診斷豬鏈球菌感染的一個(gè)重要診斷因子和具有免疫保護(hù)抗原。甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (GAPDH)是一種糖酵分解反應(yīng)酶，具有增強(qiáng)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、促進(jìn)細(xì)菌與宿主細(xì)胞之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[8-9]，sly+/gdh+/gapdh+ 3個(gè)基因均為陽性表明菌株具有在感染組織內(nèi)侵襲并導(dǎo)致宿主的致病性。而fbps基因表達(dá)的是纖連蛋白和血纖蛋白原的結(jié)合蛋白(fbps)，fbps參與細(xì)菌粘附、定植和感染的重要基礎(chǔ)[10]，毒力相關(guān)序列orf2在強(qiáng)弱毒株之間的序列存在差異，這兩個(gè)基因均為陰性，這種差異可能與菌株致病性有關(guān)[11]。不同菌株的毒力基因攜帶模式并不一定相同，此次血培養(yǎng)分離株豬鏈球菌毒力基因攜帶模式：mrp+/ef-/sly+/gdh+/gapdh+/fbps-/orf2-，與實(shí)驗(yàn)室以往分離的豬鏈球菌2型菌株具有一定的差異性，需要進(jìn)一步的分析及今后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證毒力基因跟致病性的相關(guān)性。

本研究同時(shí)還對(duì)豬鏈球菌的7個(gè)管家基因(aroA-cpn60-dpr-gki-mutS-recA-thrA)進(jìn)行分析，經(jīng)提交網(wǎng)站(http://pubmlst.org/ssuis/)分析得出該菌株的等位基因譜為8-30-5-45-44-22-109，序列分型為ST373型別。人感染豬鏈球菌血清型5型報(bào)道比較少，在泰國(guó)、瑞典、美國(guó)、日本曾有報(bào)道過，但此次分離菌株的MLST型別為ST373，與泰國(guó)分離ST181和日本ST752型別不一樣，非同一來源菌株[10-12]，且也不是我國(guó)分離株常見的ST7型或者ST1型，應(yīng)該引起我們今后工作中的重視。同時(shí)為了解該豬鏈球菌5型菌株的藥物敏感情況，通過體外藥敏實(shí)驗(yàn)提示對(duì)氯霉素和四環(huán)素耐藥，對(duì)氨芐西林、氨芐青霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、利奈唑胺、萬古霉素、替加環(huán)素等藥物為敏感，與文獻(xiàn)報(bào)道的其他豬鏈球菌耐藥結(jié)果基本一致[13-16]。

綜上所述，福建省此次分離到的豬鏈球菌血清型5型，也提示了5型也可以引起人體感染，應(yīng)加以重視。雖然生化鑒定及質(zhì)譜分析均能鑒定到豬鏈球菌屬，但如需要進(jìn)一步分析到血清型，可采取PCR方法對(duì)莢膜分型糖(CPS)進(jìn)行血清型基因鑒定，并可測(cè)定相關(guān)的毒力基因判斷強(qiáng)弱毒株，同時(shí)由于MLST方法可以快速實(shí)現(xiàn)互聯(lián)網(wǎng)共享，可用于對(duì)豬鏈球菌5型的分子流行病學(xué)分析。

利益沖突：無