半固態發酵法釀造苦蕎小曲酒糖化工藝優化

胡 琴，曹新志*，張楷正，鐘利明

（四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644000）

苦蕎（Fagopyrum tataricum）即苦蕎麥，學名韃靼蕎麥，屬于蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrium）一年生草本雙子葉植物，是一種食藥兩用的優質糧源[1-2]。其味略苦，具有耐旱、耐寒、耐酸、耐瘠、適應性強及生長期短等特點，在全世界各地都有生產和消費[3-4]。蕎麥的種植歷史悠久，主要分為苦蕎和甜蕎兩大類[5]。苦蕎在我國已有2 000多年的栽種歷史，起源自喜馬拉雅山系東側及我國西南地區，現廣泛栽培于我國西南地區，是世界苦蕎的集中產地，常年播種面積在53萬hm2以上[6-7]。據《本草綱目》記載：“苦蕎味苦、性平寒，能實腸胃、益氣力、緩精神、利耳目、降氣、寬腸、健胃的作用”。黃酮類化合物是苦蕎中最為重要的生物活性成分[8]，具有抗病毒、清除自由基、延緩衰老、抑菌殺菌等功效[9]。苦蕎淀粉含量高于其他糧食作物，且支鏈淀粉含量豐富，是用于發酵釀造的理想原料[10]。苦蕎麥作為一種重要的農作物，為充分利用苦蕎資源，提高原料利用率，具有極高的開發價值與廣闊的開發前景。

近年來，苦蕎因其具有較高的營養價值和保健功能[10]，得到眾多專家學者的青睞。在食品方面，苦蕎被用來制作苦蕎饅頭、苦蕎醋和苦蕎茶等[11-14]。但是把苦蕎作為釀酒原料來研究的國家并不多，我國就是其中之一。如徐漢卿等[15-16]對苦蕎米酒的發酵工藝進行探究，以苦蕎和糯米為主要原料，釀得的苦蕎米酒營養豐富、口感醇厚，風味獨特，是一種符合現代人健康理念的飲品；周火玲等[7]以大曲和小曲為糖化發酵劑，入池時以荷葉墊池底，入池后使用苦蕎黃酒淋醅，建立了一種苦蕎白酒的釀造新工藝，以此法釀制的苦蕎酒，出酒率提高了7.7%，總酸、總酯含量提高了50%以上，有獨特的營養價植及絕佳的口感。

本研究以苦蕎為原料，小曲為糖化發酵劑，采用半固態發酵方法[17]，從不同小曲添加量、培菌糖化溫度及培菌糖化時間對苦蕎小曲酒培菌糖化工藝進行研究，確定其最優工藝條件，通過分析半固態發酵法苦蕎小曲酒的理化指標、感官品評與揮發性風味成分，為后續苦蕎小曲酒的工藝優化提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎：四川省涼山彝族自治州；小曲：重慶市合川區鑫星曲藥廠；酒石酸鉀鈉、五水硫酸銅、氫氧化鈉、葡萄糖、亞鐵氰化鉀、鹽酸、鄰苯二甲酸氫鉀、硫酸（均為分析純）：成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

HWS-12電熱恒溫水浴鍋：上海齊欣科學儀器有限公司；MB25水分分析儀：奧豪斯儀器（上海）有限公司制造；DL-1電子萬用爐：北京市永光明醫療儀器有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司；GZ-250-S生化培養箱：韶關市廣智科技設備有限公司；AR1140電子天平：奧豪斯國際貿易（上海）有限公司；Thermo 868 pH計：熱電（上海）科技儀器有限公司；TSQ8000氣相色譜質譜聯用（gas chromatography-mass spectrum，GC-MS）儀：美國Thermo公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 苦蕎小曲酒工藝流程及操作要點

苦蕎→浸泡→蒸糧→攤涼→拌入小曲→培菌糖化→加水發酵→蒸餾→苦蕎小曲酒

操作要點：

浸泡：苦蕎常溫水浸泡4 h，料水比1∶3（g∶mL），要求浸后苦蕎手捏易碎，無硬芯；

蒸糧：將浸泡好的苦蕎瀝去水分，于常壓下蒸煮1.5 h至苦蕎開小口；

攤涼：將蒸好的苦蕎取出后適當加水并迅速翻糧快速降溫，攤冷至品溫40 ℃左右開始下曲；

拌小曲：小曲添加量按0.6%拌入，分3次加入小曲（三次加量盡量一致）；

培菌糖化：攤涼、拌曲和上箱在2 h內完成，防止雜菌感染，以免影響培菌，在糖化溫度30 ℃條件下糖化25 h；

加水發酵：按料水比1∶2（g∶mL）加水發酵，于28 ℃恒溫發酵7 d，發酵必須密封但要保證發酵氣體能排出；

蒸餾：半固態發酵的酒醅采用液態蒸餾法，得到苦蕎小曲酒。

1.3.2 培菌糖化工藝優化單因素試驗

小曲添加量：分別稱取500 g苦蕎，按照1.3.1的工藝對苦蕎進行泡糧蒸糧后，分別添加0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%的小曲，在30 ℃條件下恒溫糖化24 h，測定其還原糖含量和淀粉含量。

在此基礎上，依次考察糖化時間（20 h、22 h、24 h、26 h、28 h）、糖化溫度（24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃）對還原糖和淀粉含量的影響。

1.3.3 糖化工藝優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以還原糖含量為評價指標，采用正交試驗對小曲添加量（A）、糖化時間（B）和糖化溫度（C）進行優化，確定苦蕎小曲酒的最佳培菌糖化條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1 糖化工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for saccharification process optimization

1.3.4 理化指標測定[18-19]

還原糖、淀粉、固形物含量的測定：參照《釀酒分析與檢測》；酒精度的測定：參考GB/T 10345—2007《白酒分析方法》中的酒精計法；總酸、總酯的測定：參考GB/T 10345—2007《白酒分析方法中的總酸、總酯測定》中的指示劑法。

1.3.5 原料出酒率的計算

1.3.6 感官評定[20]

感官評價由有專業經驗的白酒品評人員對試驗所得的原酒進行感官評定，感官評定按照食品安全地方標準DBS52/005—2014《小曲清香型白酒》中的方法進行，評分標準見表2，滿分100分。

表2 苦蕎小曲酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

1.3.7 苦蕎小曲酒揮發性風味成分分析[21]

苦蕎小曲酒中揮發性風味成分測定采用GC-MS法。

氣相色譜（GC）條件：TG-WaxMS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；載氣為高純氦氣（He），流速1.0 mL/min；進樣量1 μL，分流比30∶1；程序升溫：初始柱溫40 ℃，保留3 min，以5 ℃/min升至70 ℃，保留0 min，再以8 ℃/min升至180 ℃，保留0 min，再以20 ℃/min升至250 ℃，保留5 min。

質譜（MS）條件：離子源為電子電離（electronic ionization，EI）源；離子化電子能量70 eV；采集模式為全掃描；接口溫度230 ℃；離子源溫度280 ℃，傳輸線溫度260 ℃，質量范圍30～550 amu。

定性定量方法：將經過分析得到的總離子流圖中的各峰經質譜計算機數據系統檢索并與美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）數據庫中的標準質譜圖核對，對各揮發性成分進行定性，按峰面積歸一化法計算各風味成分的相對含量。

2 結果與分析

2.1 糖化工藝優化單因素試驗

2.1.1 小曲添加量的確定

在泡糧與蒸糧工藝都相同的條件下，小曲接種量分別采用0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%的條件下進行培菌糖化24 h，分別測定糧醅的還原糖與淀粉含量，結果見圖1。

圖1 不同小曲添加量對還原糖和淀粉含量的影響Fig.1 Effect of different Xiaoqu addition on reducing sugar and starch contents

由圖1可知，隨著小曲添加量在0.3%～1.5%范圍內的增加，淀粉含量呈先下降，后上升的趨勢，在小曲接種量達到0.6%時淀粉含量達到最低，為10.59%，小曲添加量為1.2%與1.5%時差異性不明顯（P＞0.05），其余各組之間均存在顯著性差異（P＜0.05）；糧醅中還原糖含量呈先上升再下降的趨勢，在小曲接種量達到0.6%時還原糖含量達到最高，為10.99%，并且五組變量之間均呈現顯著性差異（P＜0.05）。李大和等[22]研究的川法小曲白酒用曲量一般為0.30%～0.55%，并且經實踐生產證明隨著酒曲添加量增加，發酵過于猛烈，酒出現苦味。因此，確定最佳小曲添加量為0.6%。

2.1.2 糖化時間的確定

由圖2可知，隨著糖化時間在20～24 h范圍內的的增加，還原糖含量呈明顯的上升趨勢且慢慢趨于平穩，淀粉含量呈下降趨勢。培養到24 h時，還原糖含量為11.0%，若繼續培養，此時淀粉含量呈下降趨勢，但還原糖含量基本保持不變，其原因可能是淀粉酶活力增長緩慢甚至不增長，并且根霉、酵母等微生物的生長繁殖過多的消耗淀粉分解的還原糖[3]。而且培養時間過長容易出現老箱，還原糖含量高，發酵升溫快，對發酵不利。因此，確定最佳糖化時間為24 h。

圖2 不同糖化時間對還原糖和淀粉含量的影響Fig.2 Effect of different saccharification time on reducing sugar and starch contents

2.1.3 糖化溫度的確定

由圖3可知，不同的糖化溫度對還原糖含量的影響較大，糖化溫度在30 ℃時，還原糖含量最高，達到11.23%，此時淀粉含量最低，為10.68%。當溫度＜30 ℃時，還原糖含量低，其原因可能是根霉生長緩慢，酶活力較低。當溫度達到30 ℃后，隨著溫度的升高，可能造成根霉和曲霉的繁殖速度加快，導致中心溫度升高，箱內有悶氣，使得微生物的生長繁殖受到抑制同時使分解淀粉轉化為還原糖的能力也降低，故在30 ℃后，淀粉含量上升，還原糖含量下降。因此，確定最佳發酵溫度為30 ℃。

圖3 不同糖化溫度對還原糖和淀粉含量的影響Fig.3 Effect of different saccharification temperature on reducing sugar and starch contents

2.2 糖化工藝優化正交試驗

在單因素試驗基礎上，以還原糖含量為評價指標，進行3因素3水平正交試驗設計，正交試驗結果與分析見表3，方差分析見表4。

表3 糖化工藝優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for saccharification process optimization

由表3可知，苦蕎小曲酒培菌糖化工藝對還原糖含量的影響因素主次順序為A＞C＞B，即小曲添加量＞糖化溫度＞糖化時間，得出A2B3C2為最優組合，即小曲添加量0.6%，糖化時間25 h，糖化溫度30 ℃。在此最佳條件下進行3次平行驗證試驗，苦蕎小曲酒還原糖含量為11.33%。

表4 正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results

由表4可知，小曲添加量對糖化過程中還原糖含量有顯著性的影響（P＜0.05），而糖化時間和糖化溫度對還原糖含量的影響不顯著（P＞0.05）。

2.3 糖化過程中各指標變化

由圖4可知，在正交試驗所得最佳工藝條件下糖化，即小曲添加量0.6%，糖化時間25 h，糖化溫度30 ℃。在培菌糖化過程中，淀粉含量整體呈下降趨勢，在18 h前下降比較明顯，然后就緩慢下降。主要原因是小曲中的主要成分是根霉，在苦蕎經過蒸煮后淀粉糊化，然后加入小曲進行糖化，根霉菌吸收糊化了的淀粉為養料生長繁殖，在繁殖過程中又將淀粉轉化為還原糖，所以淀粉含量呈逐漸減少的趨勢；還原糖含量在前12 h變化不明顯，在12 h后明顯增加，在25 h還原糖含量達到最大值，然后逐漸平穩。在糖化前期主要是根霉菌和酵母菌的生長繁殖，到中期后才開始產生大量的還原糖，到了后期淀粉原料基本消耗完，所以還原糖含量在后期基本不再增加；溫度整體呈現先下降后上升的趨勢，在后期有少許的下降。由于拌曲溫度范圍在36～37 ℃左右，所以前期溫度會從拌曲溫度慢慢降至糖化溫度，隨后微生物也開始生長繁殖同時釋放熱量，所以溫度在中期持續上升，到后期營養物質耗盡微生物幾乎停止生長也就不再繼續釋放熱量，溫度就稍有下降。

圖4 糖化過程中溫度、還原糖含量和淀粉含量的變化Fig.4 Changes of temperature,reducing sugar contents and starch contents during saccharification process

2.4 苦蕎小曲酒理化指標分析

在研究確定的最佳糖化工藝條件下進行小試試驗，取3批次發酵的基酒進行出酒率、總酸、揮發酸及總酯的測定，結果見表5。由表5可知，半固態苦蕎小曲酒酒精度為51.3%vol，平均出酒率為57.25%，總酸含量為0.536 g/L，總酯含量為1.95 g/L，感官評分為83分。釀出的苦蕎小曲酒清亮透明，具有乙酸乙酯為主體的復合香氣，伴有苦蕎米特有的清香，不暴辣、不沖鼻、入口綿柔醇和、香味較協調。符合小曲固態法白酒中各項指標的要求[23]。

表5 苦蕎小曲酒品質指標分析結果Table 5 Analysis results of quality indexes of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

2.5 苦蕎小曲酒揮發性風味成分分析

由表6可知，利用GC-MS對半固態苦蕎小曲酒揮發性風味成分進行檢測，其中揮發性物質主要為有機酸、酯類、醇類、羰基化合物，其中酯類含量最多，且主要以乙酯的形式存在。半固態發酵法釀造苦蕎小曲酒共檢出31種揮發性物質，其中酯類14種，其中醇類9種，酸類3種，其他類5種。結果表明，酯類化合物是構成小曲酒揮發性香氣的重要物質，主要以乙酯的形式存在，它們賦予小曲酒水果香、花香的感官特征。醇類化合物中，除乙醇外含量較高的是異戊醇、異丁醇、苯乙醇、2-丁醇、正丙醇，其中異丁醇、正丙醇略有葡萄酒香，苯乙醇是玫瑰香味的典型代表。另外，異丁醇、異戊醇是雜醇油的主要成分，含量過高會使頭痛、頭暈等[24]。異丁醇、異戊醇等高級醇含量偏高是影響小曲酒酒質的重要問題，雜醇油形成量及其各高級醇所占百分比例，可能與酵母菌株種類、發酵溫度等因素有關，有待進一步從發酵工藝上研究改進。

表6 苦蕎小曲酒揮發性風味成分測定結果Table 6 Determination results of volatile flavor components of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

3 結論

本試驗以苦蕎為原料，以小曲為糖化發酵劑，采用半固態發酵法釀造苦蕎小曲酒，最優糖化工藝為：小曲添加量0.6%，糖化時間為25 h，糖化溫度為30 ℃。在此條件下半固態發酵法釀造苦蕎小曲酒酒精度為51.3%vol、平均出酒率為57.25%、總酸含量為0.536 g/L、總酯含量為1.95 g/L，感官評分83分。苦蕎小曲酒揮發性成分共檢出31種，其中醇類9種，酸類3種，其他類5種。本研究僅僅對糖化工藝進行了優化，后續還可以對發酵工藝進行優化及風味物質生成規律等進行研究，為半固態法苦蕎小曲酒的生產和研發提供理論依據和技術參考。