14 種中成藥微生物限度檢查方法驗(yàn)證

王麗萍

（佛山市中醫(yī)院禪城高新區(qū)醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 佛山 528000）

0 引言

微生物限度是一種藥品制劑質(zhì)量控制的檢驗(yàn)方法，即檢查非滅菌制劑（包括原料、輔料）所受微生物污染程度[1]。2005版《中國(guó)藥典》中表示[2]，所有藥品制劑在質(zhì)量控制的微生物限度檢查中，必須先使用方法學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證，用以避免因方法不合理而造成的漏檢、誤判。而2006年的“欣弗事件”與2008年的“刺五加事件”[3]進(jìn)一步給人們警示了防治藥品微生物污染的重要性，也暴露出在藥品微生物檢驗(yàn)工作上，無(wú)論是認(rèn)識(shí)還是技術(shù)層面上，都有較大的提升空間。而中成藥微生物限度檢查在我國(guó)目前狀況下尤顯重要，微生物限度檢查關(guān)注的是存在于藥品中能引起污染效應(yīng)的微生物[4]，因此，我院對(duì)中成藥進(jìn)行微生物限度檢查進(jìn)行了相關(guān)研究與分析，并使用方法學(xué)加以驗(yàn)證，通過(guò)中成藥內(nèi)微生物的含量、是否存在控制菌，為藥品制劑監(jiān)管的理論依據(jù)，從而達(dá)到控制藥品制劑質(zhì)量的效果，具體論述如下。

1 材料與方法

1.1 材料。菌株：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉。中成藥：消炎片、安坤顆粒、通心路膠囊、一清顆粒、小柴胡、清寧丸、牛黃上清片、黃芩片、藿香祛暑軟膠囊、炎熱清片、金蓮花片、清熱化毒丸、清開(kāi)靈片、虎地腸溶膠囊。儀器：凈化工作臺(tái)、生化培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱、微生物限度檢查儀以及菌落計(jì)數(shù)器等。

1.2 方法。將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念球菌以及黑曲霉分別接種于不同的培養(yǎng)基中，并根據(jù)相關(guān)操作放入合適的環(huán)境下培養(yǎng)一段時(shí)間，之后將所培養(yǎng)的培養(yǎng)物制成菌懸液，約為50～100個(gè)（cfu·mL-1）[5]。同時(shí)將所選取的中成藥樣本制成不同比劑的供試液，一般分為1∶10、1∶20、1∶50以及1∶100。最后通過(guò)常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法以及薄膜過(guò)濾法對(duì)所有樣品進(jìn)行細(xì)菌、霉菌以及酵母菌數(shù)量測(cè)定[6]。

2 結(jié)果

2.1 14種中成藥常規(guī)法的回收率。常規(guī)法中消炎片、安坤顆粒、通心路膠囊、一清顆粒、小柴胡對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉的回收率均高于70%，而清寧丸、牛黃上清片、黃芩片、藿香祛暑軟膠囊、炎熱清片、金蓮花片、清熱化毒丸、清開(kāi)靈片、虎地腸溶膠囊對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念球菌、枯草芽孢桿菌均出現(xiàn)不同的抑制作用，但對(duì)黑曲霉回收率均高于70%，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率低于30%，同時(shí)藿香祛暑軟膠囊對(duì)白色念球菌回收率低于30%，詳見(jiàn)表1。

表1 14種中成藥常規(guī)法的回收率（%）

2.2 9種常規(guī)法中抑菌中成藥培養(yǎng)基稀釋法的回收率。培養(yǎng)基稀釋法中黃芩片、藿香祛暑軟膠囊、炎熱清片、金蓮花片、清開(kāi)靈片對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念球菌、枯草芽孢桿菌的回收率均高于70%，但清寧丸、清熱化毒丸、虎地腸溶膠囊對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌回收率低于70%，牛黃上清片只對(duì)枯草芽孢桿菌回收率低于70%，詳見(jiàn)表2。

表2 9種常規(guī)法中抑菌中成藥培養(yǎng)基稀釋法的回收率（%）

3 討論

近年來(lái)，我國(guó)藥品的原料和各種制劑的進(jìn)出口量呈逐年增加的趨勢(shì)，中成藥的質(zhì)量控制是非常重要的。但由于藥品微生物限度方法學(xué)建立易受多因素影響，如藥品生產(chǎn)或運(yùn)輸或銷(xiāo)售過(guò)程中受到污染、中藥材自身成分具有一定的抑菌作用以及生長(zhǎng)環(huán)境等因素，不僅中成藥處于不穩(wěn)定狀態(tài)，具有各種不確定性，同時(shí)也可能對(duì)患者造成傷害。因此，在進(jìn)行微生物限度檢查方案時(shí)，應(yīng)考慮多因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，用以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性。

本研究顯示，常規(guī)法中消炎片、安坤顆粒、通心路膠囊、一清顆粒、小柴胡對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉的回收率均高于70%，而清寧丸、牛黃上清片、黃芩片、藿香祛暑軟膠囊、炎熱清片、金蓮花片、清熱化毒丸、清開(kāi)靈片、虎地腸溶膠囊對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念球菌、枯草芽孢桿菌均出現(xiàn)不同的抑制作用，但對(duì)黑曲霉回收率均高于70%，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率低于30%，同時(shí)藿香祛暑軟膠囊對(duì)白色念球菌回收率低于30%。說(shuō)明14種中成藥均可采用常規(guī)法進(jìn)行霉菌測(cè)定，其中除藿香祛暑軟膠囊外，也可以使用常規(guī)法進(jìn)行酵母菌測(cè)定，而消炎片、安坤顆粒、通心路膠囊、一清顆粒、小柴胡還可以進(jìn)行細(xì)菌測(cè)定。培養(yǎng)基稀釋法中黃芩片、藿香祛暑軟膠囊、炎熱清片、金蓮花片、清開(kāi)靈片對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念球菌、枯草芽孢桿菌的回收率均高于70%，但清寧丸、清熱化毒丸、虎地腸溶膠囊對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌回收率低于70%，牛黃上清片只對(duì)枯草芽孢桿菌回收率低于70%，說(shuō)明9種常規(guī)法中抑菌中成藥均可使用培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行酵母菌測(cè)定，但清寧丸、清熱化毒丸、虎地腸溶膠囊、牛黃上清片無(wú)法使用培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行細(xì)菌測(cè)定。薄膜過(guò)濾法中清寧丸、牛黃上清片、清熱化毒丸、虎地腸溶膠囊對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收率均高于70%。說(shuō)明4種培養(yǎng)基稀釋法中抑菌中成藥均可使用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行細(xì)菌測(cè)定。

綜上所述，14種中成藥對(duì)大多數(shù)菌株無(wú)抑制作用，對(duì)個(gè)別微生物菌株具有一定的抑制作用，消炎片、安坤顆粒、通心路膠囊、一清顆粒、小柴胡可采用常規(guī)法進(jìn)行微生物限度檢查，包括細(xì)菌、霉菌以及酵母菌，而黃芩片、藿香祛暑軟膠囊、炎熱清片、金蓮花片、清開(kāi)靈片可采用培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行細(xì)菌、霉菌以及酵母菌測(cè)定，清寧丸、牛黃上清片、清熱化毒丸、虎地腸溶膠囊則需要采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行細(xì)菌、霉菌以及酵母菌測(cè)定。由此可見(jiàn)，不同中成藥微生物限度檢查方式也不同，但均可通過(guò)常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法以及薄膜過(guò)濾法進(jìn)行驗(yàn)證。