豬乳中兩種蛋白質的質譜鑒定

越安琪，羅卉卉，黃衛平，陳登權，金素鈺，黃 林，鄭玉才

（1.西南民族大學生命科學與技術學院，成都610041；2.四川省涼山州畜牧獸醫研究所，四川 西昌615400）

乳是新生后代最主要的營養源，對后代早期生長發育至關重要。有關乳的研究在牛乳和人乳上的報道很多，并涉及營養學、免疫學等廣泛的研究內容［1，2］。國內對豬乳的研究報道相對較少。李衛真等［3］采用電泳方法對二花臉豬乳蛋白組分進行了分析；豬乳中常規營養成分和激素含量分析也有一些報道［4，5］；秦宜德等［6，7］、Qin等［8］對豬乳中一組高分子量蛋白進行了較深入的研究，涉及這組蛋白質的多態性、與生產性能的關聯、純化和鑒定等，但通過分離純化和部分測序等方法，仍無法確定該蛋白的種類；張水斌等［9］還對豬乳中上皮黏蛋白的多態性進行了分析；國外對豬乳的研究較多［10-12］。

凝膠電泳上顯示的豬乳蛋白質組成與牛乳有明顯差異［3］，很多蛋白質難以通過圖譜比較進行定性，影響了對豬乳的功能研究。考慮到豬乳研究對中國養豬業的實際意義，以及質譜方法在蛋白質研究中的重要技術支持［13］，本研究采用電泳技術分離豬乳中的蛋白質，并利用液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）的方法對豬乳中幾種蛋白質進行鑒定，為更好地認識豬乳的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 豬乳的采集與處理

于夏季在四川省西昌市某豬場選取健康的大白豬（Sus scrofa）8頭，試驗豬處于泌乳中期。在每頭豬的頸部肌肉注射20 IU催產素，約10 min后分別手工擠乳于大離心管中，冰凍后用冰瓶帶回實驗室超低溫冰箱保存。

將冰凍的豬乳解凍后混勻，以3 000 g于4℃離心15 min去除乳脂，取中間的脫脂乳分裝于EP管中，于-80℃保存備用。

1.2 脫脂乳中蛋白質含量測定

豬脫脂乳用去離子水適當稀釋后，用Bradford染料結合分析法測定脫脂乳中蛋白質含量［14］，以牛血清蛋白為標準品。

1.3 脫脂乳蛋白電泳

電 泳 參 照Laemmli［15］的 方 法，用MP3電 泳 槽（Bio-Rad，USA）采用12.5%的分離膠SDS-PAGE，在變性條件下分離豬脫脂乳蛋白，每孔上樣4μg乳蛋白。電泳凝膠經考馬斯亮藍染色，脫色后用凝膠成像系統（Bio-Rad，USA）拍照。

1.4 脫脂乳中3種蛋白質的質譜鑒定

將凝膠上分子質量在14.4 kD～20.0 kD的3條電泳條帶用干凈的手術刀片切下置于EP管中，由武漢金凱瑞生物工程有限公司進行質譜鑒定。首先對凝膠中的蛋白質進行烷基化和酶解，即加入終濃度10 mmol/L的二硫蘇糖醇還原蛋白質，再加入55 mmol/L碘乙酸銨烷基化，最后加入1μg胰蛋白酶過夜酶解；酶解產物用C18柱脫鹽，真空干燥后用15μL上樣緩沖液（0.1%甲酸，3%乙腈）溶解多肽；多肽混合物再用LC-MS/MS（eskperTMnanoLC，AB SCIEX Triple TOF 5600-plus）分離和鑒定；串聯質譜獲得的數據用質譜儀中的Proteinpilot軟件進行分析，檢索數據庫為uniprot-taxonomy_Sus scrofa_190507_fas?ta和uniprot-taxonomy_Bos taurus_190507_fasta，設置的可信度≥95%，unique peptides≥1。

2 結果與分析

2.1 豬乳蛋白的電泳

豬脫脂乳蛋白在12.5%的SDS-PAGE上獲得較好的分離（圖1）。由圖1可知，不同個體蛋白質組成接近，能顯示15種左右的蛋白質，并在很寬的分子質量范圍內分布。凝膠上可見豬乳中特有的1種高分子量蛋白（HMWP），酪蛋白比例較低，各種蛋白質組分的相對含量存在個體差異。

2.2 豬脫脂乳中3種蛋白質的質譜鑒定

對圖1中分子量在14.4 kD～20.0 kD的3條蛋白質區帶進行二級質譜鑒定，均獲得了多種可能的蛋白質，相關鑒定信息見表1。根據比對得分并結合分子量等信息，2種蛋白質分別為β-乳球蛋白（β-LG）和乳清酸蛋白（WAP），但有1種蛋白質（樣品號為B）未獲得可信的鑒定結果，相關信息見表2。

圖1 大白豬脫脂乳蛋白的SDS-PAGE

表1 二級質譜鑒定信息統計

表2 蛋白質質譜鑒定相關信息

3 討論

豬乳中的蛋白質是影響其營養價值的主要組分之一。本研究表明，在SDS-PAGE凝膠上，顯示的豬乳蛋白質組成明顯不同于牛乳，其中酪蛋白比例相對較低。李衛真等［3］報道，二花臉豬初乳中酪蛋白占總蛋白的比重約為48%，牛乳中酪蛋白一般占80%左右。大白豬乳蛋白電泳凝膠上也顯示出豬乳中特有的高分子量蛋白，盡管其種類還未得到鑒定［8］。

本試驗采用液相色譜-串聯質譜法定性分析了豬乳中3種低分子蛋白質，有2種蛋白質被鑒定（β-乳球蛋白和乳清酸蛋白），這對今后深入研究豬乳中蛋白質的生物學功能有重要意義。未鑒定的蛋白質在豬乳中有穩定的表達，值得今后繼續研究。電泳圖譜中這些蛋白質的分子量與其理論分子量存在一些差異，可能與其修飾有關。β-乳球蛋白是牛乳中主要的乳清蛋白；乳清酸蛋白僅存在于嚙齒動物、駱駝、兔、豬等動物的乳中，但反芻動物和靈長動物乳中未發現該蛋白［16］。乳清酸蛋白被認為與乳腺上皮細胞增殖的調控［17］及小鼠乳的抑菌活性［18］等有關。推測豬乳中的乳清酸蛋白對其乳腺的功能及哺乳仔豬有重要作用。