SHP2在難治性肝細胞癌中的水平變化及作用

劉金菊，李欽勇

臨沂市腫瘤醫院內三科，山東臨沂 276001

肝細胞癌可由慢性肝病和肝硬化發展而來[1-2]。盡管這種疾病可通過手術切除進行治療，但由于腫瘤范圍或潛在的肝功能不全，大多數患者不符合手術條件[3-4]。現階段還可通過肝移植、經皮乙醇或乙酸消融、經動脈化療栓塞等方法治療，治療方案的選擇取決于疾病病程和潛在肝臟疾病的嚴重程度[4]。但由于手術切除后頻繁復發及患者對常規化療的反應較差，肝細胞癌長期生存情況并不理想。調查顯示，每年肝細胞癌的病死與全球發病人數相似，這也突顯了這種侵略性疾病的高病死率[5]。越來越多的證據顯示，肝細胞癌的化學抗性、頻繁復發均與肝細胞癌干細胞存在關聯，因此，探討肝細胞癌干細胞關聯的分子機制可制訂出更有效的治療策略[6-8]。由PTPN11編碼的含Src-homology 2結構域的磷酸酶SHP2是完全激活細胞外信號調節激酶所必需的，在細胞存活和生長中起正調節作用[9-10]。NEEL等[11]研究顯示，有條件的SHP2消融可顯著減弱部分肝切除術后細胞外信號調節激酶激活和肝臟再生。還有研究表明，肝細胞特異性SHP2消融增加膽汁酸分泌，這一過程促進相關蛋白的合成和肝細胞癌的發展[12]。本文主要研究難治性肝細胞癌中SHP2的水平變化及其對肝細胞癌干細胞擴增的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株SMMC-7721裸鼠模型建立 人肝細胞癌細胞株SMMC-7721購自中國科學院典型培養物保藏中心。BALB/c-nu裸鼠，雌性，4～6周齡，體質量(16±3)g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證：SCXK(滬)2012-0002，SPF級飼養。在37 ℃、5% CO2條件下，DMEM培養基中培養SMMC-7721細胞。將對數生長期的SMMC-7721細胞胰酶消化、離心和計數后，用生理鹽水制成細胞懸液。按2×105的劑量將細胞懸液接種于裸鼠背部皮下，約2周后分離腫塊，將其切為0.1 cm3的立方體，接種于裸鼠右腋下，共16只。隨機將裸鼠分為順鉑組和對照組，每組8只。放歸飼養后，順鉑組裸鼠每隔1 d瘤內注射2 mg/kg順鉑，對照組以等體積磷酸鹽緩沖鹽水替代。期間觀察第0、3、6、9天的腫瘤體積，測量長度和寬度。腫瘤體積(cm3)=1/2×長度×寬度2。喂養7周后處死裸鼠，完全切除富含順鉑耐藥細胞的殘留癌組織(順鉑組)和完整癌組織(對照組)。

1.1.2患者組織裸鼠模型建立 隨機取本院就診的2例難治性肝細胞癌患者腫瘤組織標本。將癌組織切成0.1 cm3的體積，并分別皮下接種裸鼠，1例患者的標本接種8只，分開飼養，其中4只裸鼠使用索拉非尼(購自德國Bayer公司)進行治療，劑量30 mg/kg，列為索拉非尼1組(n=4)；另1例患者標本接種裸鼠后同樣處理，列為索拉非尼2組(n=4)。其余8只使用等體積磷酸鹽緩沖鹽水替代索拉非尼，列為空白組1組(n=4)和空白2組(n=4)。難治性肝細胞癌納入標準：初確診時診斷為肝細胞癌，經穿刺活檢病理確認；為復發疾病，或存在轉移病灶；手術取樣或有活檢留樣。本研究動物實驗經本院倫理委員會批準且符合倫理學要求。

1.2方法

1.2.1引物序列和Western blot檢測 計算腫瘤體積后，將一部分組織標本置于液氮中，進行實時熒光定量PCR和Western blot檢測。使用ABI PRISM 7300序列檢測器(Applied Biosystems)通過PCR確定特定轉錄本的原始量。使用IRDye 800CW偶聯抗體和LI-COR成像系統通過Western blot分析肝細胞癌細胞的蛋白質提取物。SHP2(人)PCR上游引物序列：5′-CTG CCT CCA CAC CAG TGA TA-3′，下游引物序列：5′-GGA GCC TGA GCA AGG AGC-3′。 SHP2序列置亂：5′-GGA CTC AA-TTT GTG AGA AT-3′。SHP2抗體(兔多克隆抗體)購自Abcam公司(中國，ab17940)。

1.2.2肝細胞癌干細胞中SHP2相對表達水平的檢測 人肝細胞癌細胞株于37 ℃、5 % CO2條件下培養，貼壁細胞80%密度時除去培養基，胰蛋白酶消化。消化完成后加入新鮮培養基，按1∶4進行傳代培養。待80%貼壁細胞從培養瓶壁完全消化下來后，離心收集細胞，緩沖液洗滌后加入無血清含雙抗培養基培養。待懸浮細胞長至70～80 nm穩定傳代肝細胞癌干細胞。選擇肝細胞癌細胞株SMMC-7721、LM3、HepG2和Huh7按照上述方法培養，PCR檢測SHP2的相對表達水平，以培養的貼壁細胞作為對照。上述細胞株均購自中國科學院典型培養物保藏中心。相對表達水平采用2-ΔΔCt計算。

1.2.3SHP2對肝細胞癌干細胞擴增的影響 表達SHP2的腺病毒購自Vigene Bioscience公司(中國)。SMMC-7721 shSHP2穩定細胞株使用表達shSHP2的慢病毒構建，RNA序列置亂作為對照組。在96孔培養板中培養肝細胞7 d，在顯微鏡下計數。將原代肝細胞癌的單細胞懸液接種在6孔超低附著培養板中，并感染Lenti-shSHP2和對照。使用體外有限稀釋法比較SMMC-7721、LM3細胞株Lenti-shSHP2和對照組中肝細胞癌干細胞頻率。使用泊松分布統計數據和L-Calc軟件程序(版本1.1)分析肝細胞癌干細胞的比例。將被慢病毒感染的細胞接種于NOD/SCID鼠(購自上海斯萊克實驗動物有限公司，3～8周齡，許可證同BALB/c-nu裸鼠)皮下，注射細胞量為1 000～100 000，7周后評估腫瘤發生情況，處死并取出腫瘤，比較腫瘤大小。

2 結 果

2.1對照組和順鉑組裸鼠腫瘤體積、SHP2水平比較 隨著飼養時間增加，對照組裸鼠腫瘤體積明顯增加(F=30.964，P<0.001)，且明顯高于同時間段順鉑組；而順鉑組腫瘤體積隨著時間增加無明顯變化(F=1.194，P=0.330)。比較2組裸鼠SHP2蛋白水平和mRNA的相對表達水平，結果顯示，順鉑組SHP2蛋白水平和mRNA的相對表達水平均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.001)，見表1、2。

表1 不同飼養時間對照組和順鉑組腫瘤體積比較

2.2空白組和索拉非尼組裸鼠SHP2水平比較 空白1組和空白2組SHP2蛋白水平和mRNA的相對表達水平均明顯低于索拉非尼1組和索拉非尼2組，差異有統計學意義(P<0.001)。見表3。

表2 對照組和順鉑組SHP2蛋白水平和mRNA的相對表達水平比較

表3 對照組和索拉非尼組裸鼠SHP2蛋白水平和mRNA的相對表達水平比較

組別蛋白mRNA空白2組1.01±0.300.98±0.01索拉非尼2組2.16±0.432.54±0.40t6.2047.798P<0.001<0.001

2.3不同細胞株貼壁細胞和肝細胞癌干細胞中SHP2 mRNA的相對表達水平比較 在肝細胞癌細胞株SMMC-7721、LM3、HepG2和Huh7中，相較于貼壁細胞，肝細胞癌干細胞中SHP2 mRNA的相對表達水平明顯增加，差異有統計學意義(P<0.001)。見表4。

表4 不同細胞株貼壁細胞和肝細胞癌干細胞中SHP2mRNA的相對表達水平比較

2.4SHP2對肝細胞癌干細胞擴增的影響 與RNA序列置亂的對照比較，shSHP2穩定轉染的肝細胞癌細胞中球狀體的比例降低，差異有統計學意義(P<0.01)，見表5。接種于NOD/SCID鼠后，相較于SMMC-7721對照組，SMMC-7721 shSHP2組致腫瘤數更少，但2組數據差異無統計學意義(P>0.05)，見表6。

表5 SMMC-7721和LM3細胞株球狀體比例比較(%)

表6 不同細胞注射量SMMC-7721對照組和SMMC-7721shSHP2組在NOD/SCID鼠中的致腫瘤數(n/n)

3 討 論

許多肝細胞癌患者就診時即被診斷為晚期，錯過了進行手術治療的機會[13]。由于肝細胞癌的化學耐藥性，包括肝動脈化療栓塞術在內的常規化療很大程度上對患者無效[14]。對于那些接受手術切除的患者，頻繁的復發會導致生存期較差。因此，針對此類患者癌組織特異性指標變化的研究尤為重要，可用于臨床早期疾病診斷。

本研究結果顯示，隨著時間的增加，給予治療的順鉑組裸鼠的腫瘤體積未明顯增加，而未給予順鉑的對照組腫瘤體積變化明顯。處死裸鼠后，比較2組SHP2蛋白水平和mRNA的相對表達水平，結果顯示，SHP2的表達在順鉑耐藥的肝細胞癌癌組織中顯著增加，這說明SHP2的表達與化學耐藥性相關。為了驗證這一結果，筆者取2例難治性肝細胞癌患者(索拉非尼耐藥)病理組織標本建立移植瘤模型。比較2組裸鼠SHP2的表達發現，相較于對照組裸鼠，難治性肝細胞癌移植癌組織SHP2蛋白水平和mRNA的相對表達水平更高。因此，筆者推測SHP2表達與化學抗性或肝細胞癌復發相關。

肝細胞癌干細胞的存在被認為是腫瘤化學抗藥性和肝細胞癌復發的起源[15]。因此，破譯肝細胞癌干細胞調控的分子機制，是開發針對肝細胞癌干細胞新型治療策略的熱點和重點。考慮SHP2在難治性肝細胞癌中的異常表達和肝細胞癌干細胞在難治性腫瘤中的重要性，本研究用貼壁細胞作對照，比較其與肝細胞癌干細胞中SHP2 mRNA的相對表達水平。結果顯示，肝細胞癌細胞株SMMC-7721、LM3、HepG2和Huh7的肝細胞癌干細胞中SHP2 mRNA的相對表達水平明顯增加。為了驗證這一結果，筆者構建shSHP2表達穩定肝細胞癌細胞株(SMMC-7721和LM3)，以RNA序列置亂為對照，比較肝細胞癌干細胞比例。結果顯示，shSHP2穩定轉染的肝細胞癌細胞中球狀體的計數比例降低。接種于NOD/SCID鼠后，相較于SMMC-7721對照組，SMMC-7721 shSHP2組致腫瘤數更少。因此，shSHP2穩定轉染的肝細胞癌細胞中干細胞的比例降低，說明SHP2耗竭降低了肝細胞癌干細胞的比例。盡管如此，SHP2在肝細胞癌干細胞中的作用仍不清楚，需要進一步研究討論。