超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定大米中5種農藥殘留

孫春發

（安徽省化工研究院，安徽 合肥230041）

大米中的甲氧蟲酰肼、茚蟲威、嘧菌酯、戊唑醇和仲丁靈測定的國家標準是GB/T 20770-2008《糧谷中486種農藥及其相關化學品殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》，標準方法中通過乙腈提取，提取液旋轉蒸發濃縮至近干，環己烷+乙酸乙酯（V/V=1∶1）混合溶劑溶解殘渣，再通過凝膠滲透色譜儀凈化樣品，凈化后樣液再次旋轉蒸發濃縮近干后，在氮氣下吹干，乙腈+水（V/V=3∶2）混合溶劑溶解定容，過有機相濾膜，濾液通過LC-MS/MS測定，整個實驗過程比較復雜，耗時長，試劑消耗量大。因此很有必要開發一種新型快速有效的同時測定大米中5種農藥的檢測方法。QuEChERS方法是由Anastassiades教授等開發的農藥殘留前處理方法，具有快速、準確、穩定、安全等特點，近年來在農藥殘留檢測中已得到廣泛應用。

本研究采用了QuEChERS 方法來進行大米中農藥殘留的檢測，建立了大米中5種農藥的快速超高效液相色譜-串聯質譜分析方法，比較了不同提取溶劑的提取率，以及不同凈化方式的樣品凈化效果，結果表明，運用QuEChERS 方法能夠快速、簡單、廉價、高效、靈活、穩定、有效和安全地完成大米中5種農殘的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

WATERS ACQUITY I-CLASS 型超高效液相色譜儀，美國Waters；WATE-RS-XEVO-TQ-S-MICRO 型三重四級桿質譜儀，美國Waters；Vortex-Genie2 型渦旋混合器，美國Scientific Industries；JP-100ST型超聲波清洗機，深圳市潔盟清洗設備公司；TDL-40B型離心機，上海飛鴿科學儀器公司；BSA224S型電子天平，賽多利斯。

乙腈，色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；甲酸，色譜純，天津賽孚瑞科技有限公司；蒸餾水，屈臣氏；乙腈，分析純，西隴科學；乙酸，分析純，國藥集團；MASQuEChERS 萃取鹽包、4.0 g MgSO、1.5 g NaCl、1.0 g 檸檬酸鈉、0.5 g 檸檬酸氫二鈉，北京艾杰爾科技有限公司；WondaPak QuEChERS SPE 2 mL PSA/C18 凈化管（25 mg PSA，25 mg C18, 150 mg MgSO），上海嘉恒生物科技有限公司。

標準品：甲氧蟲酰肼、茚蟲威、嘧菌酯、戊唑醇、仲丁靈，100 mg/L，北京壇墨質檢科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC? BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μ m）色譜柱，柱溫：35℃，進樣體積：2 μL，流速：0.4 mL/min；流動相：(A)0.1%（V/V）甲酸水與(B)乙腈組成，梯度洗脫程序：0～1.0 min，90A%～50A%；1～2 min，50A%～20A%；2～3 min，20A%～10A%；3～4 min，10%A；4～4.5 min，10A%～90A%；4.5～5.0 min，90A%。

1.2.2 質譜條件

在電噴霧離子源下通過正離子模式進行掃描，離子源溫度：150℃，毛細管電壓：1.98 kV，脫溶劑溫度：500℃，脫溶劑氣流量：800 L/h，錐孔氣流量：20 L/h，檢測方式：多重反應監測（MRM）模式。5種農藥具體質譜分析條件見表1。

表1 5種農藥的質譜分析條件

1.2.3 標準溶液的配制

單個標準溶液的配制:用移液槍準確吸取甲氧蟲酰肼、茚蟲威、嘧菌酯、戊唑醇和仲丁靈標準溶液（100 mg/L）各1 mL，分別置于5個不同的10 mL容量瓶中，加入色譜乙腈稀釋定容，渦旋混勻，配成10 mg/L 標準工作溶液待用?；旌蠘藴嗜芤旱呐渲疲悍謩e用移液槍準確吸取甲氧蟲酰肼、茚蟲威、嘧菌酯、戊唑醇和仲丁靈標準溶液（100 mg/L）各1 mL置于同一10 mL容量瓶中，色譜乙腈稀釋定容，渦旋混勻，配成10 mg/L 混合標準工作溶液，再依次稀釋成5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μ g/L、200μ g/L的標準混合溶液。

1.2.4 樣品提取

準確稱量大米粉樣品5.0 g 置于50 mL 離心管中，先加入5 mL蒸餾水渦旋2 min，再加入10 mL乙腈溶液渦旋混勻，超聲提取10 min，加入MAS-QuEChERS 萃取鹽包，快速劇烈振搖30 s，讓鹽包充分散開與樣品均勻混合，5 000 r/min離心5 min，待凈化。

1.2.5 凈化

取待凈化樣液2 mL置于QuEChER凈化管（25 mg PSA，25 mg C18，150 mg MgSO）中，充分渦旋混勻2 min，置于離心機中8 000 r/min離心后，取上清液過0.22 μ m濾膜，供UPLC-MS/MS測定。

2 結果與分析

2.1 流動相的比較與選擇

液相流動相的組成不僅會影響到目標化合物的保留時間和峰型，還會影響到離子化效率，從而影響檢測靈敏度。在流動相中添加一些有助于目標物離子化和緩沖溶液pH 的物質，會優化峰型，提高柱效，通常在正離子模式下添加甲酸，負離子模式下添加乙酸銨等來增強離子化效率和優化峰型。本實驗分別進行了甲醇-0.1%（V/V）甲酸水溶液作為流動相與乙腈-0.1%（V/V）甲酸水溶液作為流動相的實驗比較，結果表明，在乙腈-0.1%（V/V）甲酸水流動相體系下，5種農藥的峰型尖銳，響應值更大。

圖1 5種農藥的化學結構式

2.2 質譜條件的選擇與優化

根據五種農藥的化學結構式（見圖1）判斷，5 種農藥可以通過ESI+正離子模式來同時監測。本方法通過分別將100 μ g/L 的甲氧蟲酰肼、茚蟲威、嘧菌酯、戊唑醇和仲丁靈標準溶液注入液相質譜系統，在正離子掃描模式下，通過儀器的Intellistar 自動優化功能分別找到了最佳質譜參數下5種農藥的母離子與子離子，根據碎片離子響應值強度大小選擇出了定量離子和定性離子，圖2 為在優化后的MRM 模式條件下5 種農藥的液相色譜-質譜圖，均得到了較好的峰型。甲氧蟲酰肼和戊唑醇保留時間雖然基本一致，但在多通道MRM 模式下并不影響分析檢測。

圖2 5種農藥MRM模式下標準色譜圖（從上到下依次為茚蟲威、嘧菌酯、甲氧蟲酰肼、戊唑醇、仲丁靈）

2.3 提取溶劑的選擇與比較

糧谷不同于水果蔬菜，含水量很小，而QuEChERS最初為針對含水量大于75%的樣品所設計，對于糧谷這種干燥的樣品，在處理時要加入一定量的水，但是對于不同農藥的不同基質，也有不加水直接加入提取溶劑對樣品進行提取的，如沈菁等通過直接用乙腈提取大米中呋喃丹的殘留量，完成了大米樣品中農藥殘留的快速分析。

本研究比較了5 種農藥在大米粉中加水浸潤后提取和不加水直接提取，結果表明，當加入少量水浸潤后，再用乙腈進行提取的5 種農藥的回收率都稍微高于不加水的，且基質響應更小一些。這是由于加水后更加有利于易溶于水的雜質的去除，同時加水能讓提取溶劑和大米樣品充分接觸，提高了農藥的回收率。最終研究表明，稱取5 g樣品、5 mL水、10 mL乙腈提取，得到了良好的回收率。

2.4 凈化效果的比較

本研究比較了不凈化、采用Carb/NH 固相萃取柱和QuEChERS 凈化管（25 mg PSA，25 mg C18,150 mg MgSO）的凈化效果，結果表明，不凈化直接進樣時，基質效應嚴重，雜質峰較多。這是由于大米中含有較多的蛋白質和脂肪，極大地干擾了目標農藥的檢測，樣品通過Carb/NH固相萃取柱凈化后的基質效應最小，回收率為87%～97%，而QuEChERS 凈化管的基質效應略大一些，回收率為82%～91%。但是考慮到通過固相萃取柱(SPE)凈化需要通過柱子活化、樣品過柱、洗脫除去雜質、干燥、再洗脫收集目標物，步驟繁雜，消耗試劑量大，且價格相對昂貴，耗時費力，不適用于大批樣品的快速分析檢測。而QuEChERS 方法采用分散的固相萃取柱凈化，節省了大量的時間和試劑，且有利于環境保護，對實驗人員的身體傷害較小，且也得到了較好的回收率，能夠滿足農藥殘留檢測的相關要求，因而最終采用QuEChERS凈化管凈化方式進行實驗。

2.5 方法驗證結果

2.5.1 方法的檢出限、定量限與線性關系

在優化后的液相色譜和質譜條件下，取5 μ g/L、10 μ g/L、20 μ g/L、50 μ g/L、100 μ g/L、200 μ g/L農藥標準混合溶液各2 μ L 進樣，相當于檢測樣品含量在0.01～0.4 mg/kg（對于樣品殘留量較大的可采取稀釋進樣），以5種農藥標準溶液濃度與對應的定量離子峰面積作標準曲線，結果表明，5 種農藥在濃度范圍內的線性關系良好，且相關系數R為0.995～0.999，5種農藥的檢出限為0.001～0.003 mg/kg，定量限為0.004～0.01 mg/kg，結果見表2。

表2 5種農藥的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限、定量限

2.5.2 方法的準確度與精密度

分別在大米粉空白樣品中添加0.01 mg/kg、0.05 mg/kg和0.2 mg/kg 三檔不同濃度的5種農藥的混合標液，按照1.2.4～1.2.5 方法處理，重復6 次，測定并計算加標回收率，以添加回收率評價準確度，以相對標準偏差（RSD）評價精密度，5 種農藥在大米中平均添加回收率為88%～100%，相對標準偏差（RSD）為1.4%～4.8%，結果見表3。

表3 5種農藥的平均回收率及相對標準偏差

3 結論

本文建立了一種通過QuEChERS-UPLC-MS/MS 來檢測大米中5 種農藥殘留的檢測方法。通過加水潤濕大米再加入乙腈和QuEChERS萃取鹽包混合提取，采用QuEChERS 凈化管(25 mg PSA，25 mg C18,150 mg Mg-SO)凈化，代替了傳統的固相萃取柱(SPE )凈化，在5 min內實現了大米中5種農藥在UPLC-MS/MS上的分析檢測。本方法快速、簡單、廉價、高效、靈活、穩定和有效，節省了大量的時間、試劑和成本，5種農藥在大米中的檢出限、定量限、回收率、精密度、準確度均滿足農藥殘留檢測相關要求，可用于大米中5種農藥的日常檢測和篩查分析等。