夾脊電針通過(guò)PTEN通路對(duì)脊髓損傷自噬的影響

李竹馨,尹洪娜,李海燕,李晨陽(yáng),王雪,孫忠人*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是一種復(fù)雜且具有破壞性的疾病，其特征是下行、上行和內(nèi)在脊髓傳導(dǎo)中斷[1]，導(dǎo)致慢性神經(jīng)功能缺失，損傷平面以下出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能喪失，感覺受損，嚴(yán)重?fù)p傷自主神經(jīng)系統(tǒng)。據(jù)估計(jì)，每年全球SCI的發(fā)病率在25萬(wàn)～50萬(wàn)人之間[2]，患者往往在最具生產(chǎn)力的時(shí)期殘疾，這對(duì)個(gè)人和社會(huì)都有巨大的身體、情感和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。大量研究表明夾脊電針產(chǎn)生的脈沖電場(chǎng)對(duì)SCI修復(fù)具有促進(jìn)作用，包括減輕繼發(fā)性損傷和促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)與再生[3-4]。

自噬是一種具有神經(jīng)保護(hù)特性的溶酶體依賴的細(xì)胞降解途徑，越來(lái)越多的證據(jù)表明，在SCI中自噬可以起到中樞神經(jīng)損傷后的神經(jīng)保護(hù)作用[5-6]。自噬體的出現(xiàn)標(biāo)志著自噬進(jìn)程開始，自噬相關(guān)基因微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)在細(xì)胞內(nèi)以LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式出現(xiàn)，自噬形成時(shí)，胞漿型LC3(即LC3-Ⅰ)會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即LC3-Ⅱ)，因此，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的動(dòng)態(tài)變化可評(píng)估自噬水平的高低。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)參與自噬體的誘導(dǎo)及形成，在自噬起始階段對(duì)細(xì)胞自噬起負(fù)調(diào)控作用。作為自噬經(jīng)典通路PI3K/AKT/mTOR的上游蛋白，磷酸酯酶與同源張力蛋白(phosphatase and tensin homolog, PTEN)異常表達(dá)與自噬相關(guān)[7]，是一種有前景的SCI治療靶點(diǎn)，越來(lái)越多的研究表明PTEN在自噬介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷后修復(fù)起到重要作用[7-9]。PTEN特異性抑制劑bpV(HOpic)主要應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(singnal transducers and activators of transcription 3, STAT3)是調(diào)控神經(jīng)發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子，在創(chuàng)傷、炎癥或缺血導(dǎo)致永久性軸突損傷的神經(jīng)疾病中誘導(dǎo)STAT3持續(xù)表達(dá)，有助于改善神經(jīng)功能恢復(fù)[10]。本研究涉及的主要路徑敘述如圖1。

圖1 PTEN/mTOR/STAT3通路示意圖

那么夾脊電針治療SCI是否通過(guò)影響自噬上下游分子起到治療作用呢？本研究觀察抑制PTEN后，夾脊電針對(duì)SCI大鼠運(yùn)動(dòng)功能和脊髓組織中LC3-Ⅱ/Ⅰ、mTOR和STAT3含量的影響，闡述夾脊電針對(duì)PTEN/mTOR/STAT3通路和自噬的影響，以期為夾脊電針治療SCI提供一定的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠120只，購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK(黑)2013-012，體質(zhì)量180～220 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)針灸臨床神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房，室溫(25±3)℃，濕度(55±5)%，保持12 h/12 h晝夜循環(huán)，給予標(biāo)準(zhǔn)飲食、自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器和試劑

NYUImpactor M-Ⅲ型脊髓打擊器(美國(guó))；手術(shù)器械(上海元洪醫(yī)療器械有限公司)；KWD 808Ⅱ電麻儀(中國(guó)長(zhǎng)城)；0.25 mm×13 mm針灸針(吳江市云龍醫(yī)療器械有限公司)；抑制劑bpV(HOpic)(美國(guó)Med Chem Express)；Nano Quant infinite M200PRO多功能酶標(biāo)儀(瑞士TECAN)；大鼠LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、mTOR、STAT3 ELISA試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司)。

1.3 造模與干預(yù)方法

1.3.1 分組與造模

采用隨機(jī)數(shù)字表法，將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、模型(Model)組、電針(EA)組、bpV組和EA+bpV組，每組分為1、3、7、14 d等4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每組6只。假手術(shù)組去除椎板暴露脊髓，但不對(duì)脊髓進(jìn)行打擊，模型組、電針組、抑制劑組和抑制劑+電針組在大鼠第10胸椎椎骨平面用打擊器以50 g·cm的勢(shì)能撞擊脊髓，以撞擊后大鼠出現(xiàn)深長(zhǎng)呼吸、擺尾、脊髓血管紅腫作為SCI造模成功的標(biāo)志[11]。

1.3.2 分組治療

于造模成功后次日開始治療。抑制劑+電針組每日電針治療前10 min腹腔注射抑制劑bpV 0.2 mL(200 μL/kg，溶于生理鹽水中，-80 ℃凍存)，模型組、假手術(shù)組和電針組大鼠腹腔注射0.2 mL生理鹽水。電針組方法：將大鼠固定后，在造模時(shí)標(biāo)記處相鄰上、下棘突間隙距正中線3～4 mm處進(jìn)行毫針針刺，針刺深度4～5 mm，電極線以正極在上、負(fù)極在下的方式連接同側(cè)穴位。選擇連續(xù)波(頻率為100 Hz)，電流強(qiáng)度約為1 mA，30 min/d，按不同時(shí)間點(diǎn)分別連續(xù)治療1、3、7、14 d。療程完成后分別于次日取材，將損傷組織取出約1 cm長(zhǎng)，從橫截面正中間剪斷，取其中50%凍存于-80 ℃冰箱中待檢測(cè)。每天進(jìn)行2次人工擠壓膀胱排尿。

1.4 行為學(xué)評(píng)價(jià)

采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評(píng)分量表[12]對(duì)SCI大鼠行走、步態(tài)、肢體協(xié)調(diào)性、腳掌位置和身體穩(wěn)定性進(jìn)行綜合分析后進(jìn)行打分。各組大鼠分別于麻醉前、每次治療前置于開放視野場(chǎng)地自由活動(dòng)5 min，由兩名熟悉此表但對(duì)分組未知的研究人員進(jìn)行交叉評(píng)價(jià)取均值記錄分?jǐn)?shù)。量表范圍為0～21分，0分代表完全癱瘓，21分代表運(yùn)動(dòng)功能正常。

1.5 ELISA檢測(cè)法檢測(cè)脊髓中LC3-Ⅱ/Ⅰ、mTOR和STAT3含量

ELISA試劑盒使用前在常溫下平衡20 min，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，樣本孔先加待測(cè)組織上清液10 μL，再加樣本稀釋液40 μL。標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，37 ℃恒溫箱溫育60 min。洗板，每孔加入底物A、B各50 μL，避光孵育，加入終止液，測(cè)定各孔的OD值，計(jì)算擬合曲線并換算樣本濃度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BBB評(píng)分情況

見表1和圖2。與Sham組比較，其余各組評(píng)分均顯著降低(P<0.05)。與Model組相比，在1 d時(shí)，EA組、bpV組和EA+bpV組評(píng)分均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而在3、7、14 d時(shí)差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明此時(shí)各治療組開始起到恢復(fù)大鼠運(yùn)動(dòng)功能的作用。與EA組相比，bpV組在各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。與EA組和bpV組相比，EA+bpV組在1 d和3 d時(shí)無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而在7 d和14 d時(shí)評(píng)分進(jìn)顯著增高(P<0.05)。

表1 各組BBB評(píng)分表比較分)

2.2 脊髓組織LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ含量的比值

見表2和圖3。與Sham組相比，Model組各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。從3 d起，與Model組相比，EA組LC3-Ⅱ/Ⅰ顯著升高(P<0.05)。與EA組相比，各時(shí)間點(diǎn)的bpV組比值均顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明EA較bpV更能引起自噬的發(fā)生。與EA組相比，EA+bpV組在7 d和14 d時(shí)具有顯著性差異(P<0.05)。

圖2 各組大鼠BBB評(píng)分比較

表2 各組脊髓組織LC3-Ⅱ/Ⅰ比較

圖3 各組脊髓組織LC3-Ⅱ/Ⅰ比較

2.3 脊髓組織mTOR含量

見表3和圖4。Sham組和Model組在各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著性變化(P>0.05)。與Model組比較，EA組在3、7、14 d具有顯著性差異(P<0.05)。bpV組與EA組在各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。與Model組相比，EA+bpV組只在3 d時(shí)有顯著性差異(P<0.05)。

表3 各組脊髓組織mTOR含量比較

圖4 各組脊髓組織mTOR含量比較

2.4 脊髓組織STAT3含量

見表4和圖5。1 d時(shí)各組均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。3 d時(shí)EA組分別與Sham組和Model組比較，均具有顯著性差異(P<0.05)。與EA組比較，bpV組和EA+bpV組在3、7、14 d均具有顯著性差異(P<0.05)。

表4 各組脊髓組織STAT3含量比較

圖5 各組脊髓組織STAT3含量比較

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為本病病因?yàn)椤澳I督虛寒”“瘀血留于太陽(yáng)經(jīng)中”，因此多以溫通督脈法為主，同時(shí)重視疏通膀胱經(jīng)氣血，以此進(jìn)行中藥配伍和針灸取穴[13-14]。夾脊穴在督脈與膀胱經(jīng)之間，同時(shí)接受督脈陽(yáng)氣的溫煦和膀胱經(jīng)氣血的濡養(yǎng)。而且夾脊穴在后正中線旁開0.5寸胸椎棘突下，深部有脊神經(jīng)和交感神經(jīng)，針刺深度達(dá)到接近神經(jīng)根處為最佳[15]。隨著交通運(yùn)輸業(yè)與建筑業(yè)的蓬勃發(fā)展，脊髓損傷發(fā)病率逐年升高，患者承受著沉重的心理與經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前臨床指南推薦胸腰段脊髓損傷后行手術(shù)治療或佩戴胸腰骶支具8～10周的保守治療[16-17]。納米醫(yī)學(xué)和組織工程被認(rèn)為是很有前途的治療方法，通過(guò)植入或注射生物材料支架來(lái)增強(qiáng)軸突生長(zhǎng)和方向性，但轉(zhuǎn)化成臨床成果需要考慮安全性和巨大的經(jīng)濟(jì)投入[18]。電刺激產(chǎn)生的電場(chǎng)與人體的生物電協(xié)同作用于脊髓軸突生長(zhǎng)，在脊髓損傷部位遠(yuǎn)端施加電場(chǎng)刺激(EFS)可以延緩和減弱脊髓損傷電位的形成[4]，夾脊電針基于中醫(yī)辨證論治的理論與實(shí)踐基礎(chǔ)，以針灸針作為電極實(shí)現(xiàn)了接近損傷部位的電場(chǎng)刺激，延緩脊髓繼發(fā)性損傷，改善神經(jīng)功能，但具體作用機(jī)制仍不明確。

本研究首次通過(guò)PTEN/mTOR/STAT3信號(hào)通路調(diào)控的自噬研究夾脊電針的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)抑制PTEN后，自噬水平上調(diào)。結(jié)果顯示，在改善大鼠運(yùn)動(dòng)功能方面EA組與bpV組水平基本持平，在引起LC3-Ⅱ/Ⅰ變化和mTOR、STAT3含量變化方面EA組與bpV組具有相似的趨勢(shì)，即在3 d達(dá)到高峰，之后呈下降趨勢(shì)，與SCI損傷后的神經(jīng)修復(fù)時(shí)間基本吻合[5],說(shuō)明EA與bpV均能有效干預(yù)SCI后自噬水平。隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)，bpV+EA組的效果雖然沒(méi)有達(dá)到EA組與bpV組的完全疊加效果，但是也體現(xiàn)出了夾脊電針與bpV的協(xié)同作用，即總體效果均優(yōu)于單獨(dú)EA組與bpV組(P<0.05)。mTOR波動(dòng)水平雖然不能明確自噬期始的準(zhǔn)確情況[16]，但與LC3Ⅱ/Ⅰ相結(jié)合可以大致描述自噬的全過(guò)程(自噬流)。在今后的研究中將增加進(jìn)一步檢測(cè)mTOR磷酸化水平和p62、ATG5等自噬相關(guān)基因以求更全面地描述自噬流。

筆者研究初步表明，夾脊電針作為優(yōu)化自噬的外源性刺激促進(jìn)脊髓損傷恢復(fù)，可能與PTEN抑制劑bpV具有協(xié)同作用，能夠在通路被激活后上調(diào)細(xì)胞自噬。PTEN/mTOR/STAT3通路已經(jīng)在干預(yù)癌細(xì)胞增殖和避免心肌細(xì)胞過(guò)度增殖等方面起到顯著作用[19-20]，調(diào)節(jié)神經(jīng)元內(nèi)在PTEN/mTOR/STAT3活性是促進(jìn)成人SCI后突出再生和功能修復(fù)的潛在治療策略[21]，也是目前治療SCI機(jī)制的熱點(diǎn)。然而抑制PTEN后對(duì)通路其他相關(guān)因素如星形膠質(zhì)細(xì)胞、自噬流等方面的影響需要在未來(lái)的研究中解決，可以從組織病理形態(tài)、蛋白和mRNA含量的動(dòng)態(tài)變化等進(jìn)一步闡述夾脊電針的作用機(jī)制。