苯丁酸氮芥協(xié)同四價鉑藥物的合成與抗癌活性研究

屠思嘉，李澤寧，呂 鶴，陳 超

(湖州師范學院 生命科學學院,浙江 湖州 313000)

0 引 言

在癌癥治療中，鉑類藥物一直扮演著重要角色[1-2].其中,順鉑被用于一半以上的癌癥化療，是化療效果最好的抗癌藥物之一[3].然而，順鉑極大的毒副作用以及腫瘤細胞對其產(chǎn)生的難以克服的耐藥性，嚴重限制了其在臨床上的進一步使用[4].因此，不斷有其他鉑類藥物被研究和開發(fā).目前在臨床上已被應用的有卡鉑和奧沙利鉑.但卡鉑治療癌癥的類型與順鉑類似，對順鉑耐藥的癌細胞同樣會對卡鉑耐藥，并且卡鉑還具有嚴重的骨髓抑制作用[5].雖然奧沙利鉑治療癌癥的類型與順鉑不同，而且與順鉑沒有交叉耐藥性，但奧沙利鉑具有較嚴重的神經(jīng)毒性[6].

四價鉑是二價鉑的氧化態(tài)化合物，在細胞內(nèi)被抗壞血酸、谷胱甘肽等還原性分子還原為二價鉑化合物，從而發(fā)揮抗癌作用[7].作為二價鉑藥物的前藥，四價鉑除保留了二價鉑藥物廣譜高效的抗癌活性外，還具有以下優(yōu)勢：四價鉑具有六配體穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，血液穩(wěn)定性高于二價鉑；四價鉑比二價鉑多兩個配體，可方便地引入不同官能團，從而可以共價連接其他藥物；四價鉑具有不同于二價鉑類藥物的作用機制，可以克服腫瘤細胞對傳統(tǒng)鉑類藥物產(chǎn)生的耐藥性[8].本文將傳統(tǒng)的化療藥物苯丁酸氮芥通過縮合反應引入到四價鉑軸向羥基上，通過兩藥聯(lián)用，以期形成治療效果更好的抗癌藥物[9].苯丁酸氮芥是FDA認可的DNA烷基化劑，可用于治療慢性淋巴白血病、淋巴癌，以及晚期卵巢癌和乳腺癌[10].并且苯丁酸氮芥和鉑類藥物都能通過攻擊細胞中的DNA發(fā)揮抗腫瘤作用，兩藥聯(lián)用可有效增強藥物對DNA靶點的識別，從而提高藥物的治療效果.此外，苯丁酸氮芥與四價鉑的結(jié)合物能有效調(diào)節(jié)藥物的親脂性，提高細胞對藥物的攝取效率，減少細胞內(nèi)外藥物失活現(xiàn)象的出現(xiàn).

1 實驗材料與方法

1.1 實驗試劑

順二氯二氨基合鉑(cis-Pt)、過氧化氫(H2O2)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC).

1.2 二氯二羥基二氨合鉑(IV)的合成

二氯二羥基二氨合鉑(IV)的合成方法如圖1(1)所示[11].將60 mL過氧化氫(30 wt%)逐漸滴加到含有順鉑(1.0 g，3.33 mmol)的圓底燒瓶中.滴加完畢將反應混合物加熱至75 ℃攪拌5 h，然后在室溫下避光反應過夜使產(chǎn)物結(jié)晶.過濾分離黃色固體粉末，用冷水洗滌，干燥，得到1 g產(chǎn)物，產(chǎn)率為90%.

1.3 二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV)(chlorambucil-Pt)的合成

二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV)的合成分兩步進行，見圖1(2).第一步，將苯丁酸氮芥縮合形成酸酐，并將苯丁酸氮芥(303 mg，1.0 mmol)溶于20 mL干燥的二氯甲烷溶劑中，加入縮合劑二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(153 mg，0.5 mmol)，室溫攪拌3 h，薄層色譜(TLC)跟蹤反苯丁酸氮芥全部形成酸酐；第二步，過濾并除去二氯甲烷溶液，產(chǎn)物不分離，直接加入二氯二羥基二氨合鉑(IV)(80 mg，0.25 mmol)、無水二甲基亞砜(dmso)10 mL，避光室溫攪拌過夜.反應結(jié)束后減壓除去dmso溶劑.最終將產(chǎn)物二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV)通過薄層色譜提純分離，得到淺黃色粉末68 mg，產(chǎn)率為31%.

圖1 二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV)的合成Fig.1 Synthesis of chlorambucil-Pt(IV)

2 結(jié)果與討論

2.1 二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV)的質(zhì)譜和核磁表征[12]

如圖2所示，分子量905.091 9(1)處出現(xiàn)了二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV)的分子離子峰，這與理論值相符.在1H NMR圖(圖3(a))中，苯丁酸氮芥形成酸酐后與二氯二羥基二氨合鉑(IV)的兩個羥基酯化縮合，其中苯環(huán)上的芳氫以雙峰的形式分別出現(xiàn)在7.07 ppm和6.62 ppm處，N-氯乙基上的氫核磁信號以多重峰的形式出現(xiàn)在3.72～3.61 ppm處，丁酸上的亞甲基信號峰分別出現(xiàn)在2.52 ppm、2.44 ppm和1.86 ppm處，沒有發(fā)現(xiàn)羧酸氫的信號峰.與中心鉑原子配位的氨基特征峰出現(xiàn)在5.46 ppm處.苯丁酸氮芥與氨基的個數(shù)比為1∶1，說明二氯二羥基二氨合鉑(IV)上的兩個羥基都與苯丁酸氮芥進行了縮合.在13C NMR圖(圖3(b))中共出現(xiàn)了10個特征信號峰，均為苯丁酸氮芥的碳信號峰.核磁數(shù)據(jù)為：1H NMR(400,MHz，CDCl3)：δ7.07(d，J=8.4 Hz，4H)；6.62(d，J=8.4 Hz，4H)；5.44(b，6 h)；3.68～3.72(m，8 H)；3.65～3.61(m，8 H)；2.52(t，J=7.2 Hz，2H；2.44(t，J=7.2 Hz，2H)；1.86(m,2H).13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ184.2；144.4；130.5；130.0；112.2；53.5；40.8；34.2；27.5；24.8.

圖2 二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV)的質(zhì)譜圖Fig.2 The masss spectrum of chlorambucil-Pt (IV)

圖3 二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV)的核磁共振譜圖Fig.3 The 1H NMR and 13C NMR spectrum of chlorambucil-Pt(IV)

2.2 二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV)(chlorambucil-Pt)的抗癌活性

在確認和表征二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV)的結(jié)構(gòu)后，首先通過MTT(噻唑藍)比色法[13]來評估該化合物在腸癌細胞LoVo、胃癌細胞7901、非小細胞肺癌細胞A549和A549-R(耐順鉑細胞株)3種癌細胞中的細胞活性，并與臨床使用的苯丁酸氮芥和順鉑藥物進行對比.如圖4和表1所示，與苯丁酸氮芥和順鉑相比，二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV)對人類癌細胞表現(xiàn)出較高的毒性.在LoVo、7901和A549細胞中，二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV)的IC50值(藥物半抑制濃度)分別為0.53±0.03 μM、0.74±0.04 μM和1.59±0.12 μM，藥效接近或超過順鉑10倍.在耐順鉑的肺癌A549-R細胞中，二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV)表現(xiàn)出更高的細胞活性，其IC50值為1.33±0.09 μM，只有順鉑IC50值(31.0±5.50 μM)的1/20.由此表明，二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV)不會與順鉑產(chǎn)生交叉耐藥性，其能有效殺死耐順鉑的癌細胞，可用于治療對順鉑產(chǎn)生耐藥性的癌癥.

圖4 苯丁酸氮芥、順鉑和二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑作用癌細胞48 h后的MTT曲線Fig.4 MTT assay of chlorambucil，cis-Pt, and chlorambucil-Pt against cancer cell lines after 48 h drug exposure

表1 苯丁酸氮芥、順鉑和二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑作用癌細胞48 h后的IC50值

細胞的形態(tài)變化是細胞對細胞毒性試劑初步的反應指標[14].如圖5所示，健康的LoVo細胞顯示出梭形結(jié)構(gòu)(圖5(a)).用1.0 μM的二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV)處理LoVo細胞24 h后，部分細胞形態(tài)明顯縮小為圓形并有濃縮的染色質(zhì)出現(xiàn)，但是大部分細胞的形態(tài)依然正常(圖5(b)).這可能是由于LoVo細胞在短時間內(nèi)通過細胞保護機制克服了藥物作用.但延長藥物作用時間至48 h后，LoVo細胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化，大部分細胞已失去其質(zhì)膜的完整性,并出現(xiàn)明顯的核濃縮.由此表明，LoVo的細胞保護機制在二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV)的作用下已被完全破壞，并引起細胞死亡.

圖5 二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(1.0 μM)作用LoVo細胞后的細胞形態(tài)變化Fig.5 Representative images of LoVo cells treated with chlorambucil-Pt (1.0 μM)

為進一步說明二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV)在癌細胞中的作用機制，在LoVo細胞中進行膜蛋白V-FITC/PI凋亡測定，并通過流式細胞儀進行分析[15].Annexin V-FITC是一種熒光標記的磷脂結(jié)合蛋白，可以與早期凋亡細胞外翻的磷脂酰絲氨酸結(jié)合.碘化丙啶(propidine iodide，PI)是一種核酸染料，不能滲透到正常細胞和早期凋亡細胞中，但可以滲透到晚期凋亡和壞死細胞中.用1.0 μM的二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV)分別處理LoVo細胞0 h、24 h和48 h后，早期凋亡細胞的總數(shù)分別為6.0%、54.0%和94.2%(圖6)，幾乎沒有觀察到晚期凋亡和壞死細胞(PI陽性，壞死)，其種群少于5.4%.由此表明，二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV)作用細胞后，主要通過凋亡方式誘導細胞死亡.

圖6 二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(1.0 μM)作用LoVo細胞后的細胞凋亡分布情況Fig.6 Cell apoptosis in response to treatment with chlorambucil-Pt (1.0 μM)

細胞周期的停滯是細胞凋亡的一個主要原因.帶負電荷的核酸(DNA)是鉑類藥物的主要靶點[16].用1 μM的順鉑和二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV)分別處理LoVo細胞24 h后,收集細胞并通過流式細胞儀進行分析，未處理的細胞顯示出正常的周期分布百分比，G1期為42.98%、S為19.07%、G2/M期為37.94%(圖7(a)).在順鉑的作用下，在G1期A2780細胞數(shù)增加至51.65%，在S期和G2/M期的A2780細胞數(shù)分別減少至16.59%和31.75%(圖7(b)).在相同濃度的二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑作用下，在G1期A2780細胞數(shù)增加至61.66%，在S期和G2/M期A2780細胞數(shù)分別減少至14.16%和24.18%(圖7(c)).順鉑和二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV)在G1期都顯示出明顯的阻滯作用.G1期是DNA的預合成期，當細胞周期停滯在該階段時，細胞的增殖被抑制，細胞周期從G1期轉(zhuǎn)為S期和G2/M期的速度降低，最終誘導細胞膨脹和凋亡.

圖7 藥物(1.0 μM)孵育LoVo癌細胞24 h后細胞周期的分布情況Fig.7 Cell cycle distribution of LoVo cancer cells exposed to chlorambucil-Pt and cis-Pt (1.0 μM)

3 結(jié) 論

本文在二氯二羥基二氨合鉑(IV)的軸向羥基基團上通過酯化反應引入藥物苯丁酸氮芥，合成一種有前途的四價鉑前藥二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV),并通過核磁共振和質(zhì)譜分析確認二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV)的結(jié)構(gòu).研究表明，在二氯二羥基二氨合鉑(IV)軸向引入苯丁酸氮芥，能有效提高藥物的抗腫瘤活性.在細胞周期實驗中，二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV)表現(xiàn)出與順鉑相同的G1期阻滯作用，從而引起細胞凋亡.鑒于二氯二苯丁酸氮芥二氨合鉑(IV)表現(xiàn)出的協(xié)同作用方式和較強的抗癌活性，該化合物可能會成為一種潛在的抗腫瘤藥物，值得進一步研究.