研究PODXL 在腎透明細胞癌中的表達及相關意義

石磊 孫庭

（南昌大學第一附屬醫院 江西南昌330006）

從腎實質泌尿小管上皮細胞產生的惡性腫瘤稱為腎癌，同時也稱為腎細胞癌（RCC），RCC 占腎臟惡性腫瘤的85%～90%[1]， 而RCC 占成人惡性腫瘤的3.79%[2]。 RCC 的一種病理亞型腎透明細胞癌（ccRCC），占RCC 的75%[3]。 ccRCC 具有很高的轉移性和侵襲性等特性，死亡率是腎癌病理亞型中最高的類型。相關研究表明有20%～30%的腎透明細胞癌患者在初次就診時，已出現臨床轉移[4]。 在腎癌患者的治療方法中，放療及化療對于治療腎細胞癌的療效均不理想， 手術切除目前是對局部進展性腎細胞癌和局限性腎細胞癌的主要治療方法，但約30%的腎癌患者在術后出現復發和轉移[5]。 有文獻報道，美國2018 年約有65 340 例確診為腎細胞癌的患者，約有10 010 例患者死于腎細胞癌，死亡病例數明顯較前一年上升[6]。 晚期腎細胞癌治療方法甚少，多以放化療為主，且療效及預后均不佳。尋找對診斷和治療腎透明細胞癌有重要價值的生物標志物和治療靶點具有一定的臨床意義。 足細胞標志蛋白

（Podocalyxin-like Protein, PODXL）在染色體的位置位于7q32-q33 上，分子量大小為140～160 KD，屬于CD34 家族成員之一，是唾液黏蛋白的一種類型，富含負電荷，屬于高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，相關研究發現，PODXL 在腎小球足細胞、造血細胞、血管內皮細胞和乳腺上皮細胞中均有較高的表達[7～12]，PODXL 在一些腫瘤細胞中可向細胞膜突起， 并且能夠在細胞胞漿中表達，但不能在細胞核中表達[13]。有關PODXL 在生理活動過程中的作用研究發現，PODXL 能夠參與神經發育、調節血管通透性、白細胞-內皮細胞相互作用和造血等多種生理過程[14～17]。目前，PODXL 基因與腎癌疾病的關系在國內外尚未見報道， 本研究主要是通過癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫（http://cancergenome.nih.gov/）分析PODXL 在ccRCC 的表達與臨床病理學參數之間及患者預后等方面的相關性。 現報道如下：

1 資料與方法

1.1 臨床資料 從TCGA 數據庫中TCGA KIRC Cohort（Kidney Clear Cell Carcinoma）中尋找下載轉錄組測序技術（RNA-Seq）數據，通過篩選，總共保留526 例ccRCC 樣本， 其中包含72 例腫瘤組織及與其配對的癌旁正常組織。 根據腎癌美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer, AJCC）臨床分期：Ⅰ期病例數265 例，Ⅱ期病例數54 例，Ⅲ期病例數126 例，Ⅳ期病例數78 例，未知病例數3例。 包括男342 例，女184 例。

1.2 從GEPIA 數據庫引入數據 GEPIA 數據庫（http://gepia.cancer-pku.cn）是由北京大學研究開發，總共包含了TCGA 和GTEx 項目的9 736 個腫瘤和8 587 個正常樣品的核糖核酸（Ribonucleic Acid,RNA）測序表達數據，可用于在線分析基因在癌癥和正常組織中差異表達的數據庫，包括腎癌在內的共33 種惡性腫瘤[18]。 使用GEPIA 數據庫分析PODXL 在ccRCC 組織以及正常腎臟組織中的表達程度的不同。

1.3 使用受試者工作特征曲線 （ROC） 進行分析引入ROC 曲線分析下載的ccRCC 患者樣本數據共526 例與配對的癌旁正常組織72 例的PODXL mRNA 表達量，分析PODXL 表達量在診斷ccRCC中的靈敏度和特異度。比較分析526 例ccRCC 患者PODXL mRNA 表達量和相對應的臨床特征的關系， 將數據樣本按照PODXL mRNA 的標準化表達量進行由高到低的排序，將數據均分為兩等分，前半部分為高表達組， 后半部分為低表達組。 采用Kaplan-Meier 生存曲線和Log-rank 生存曲線檢驗法兩種方法，分析ccRCC 患者中PODXL mRNA 表達情況與患者生存預后的相關性。

1.4 統計方法 引入SPSS 23.0 軟件對從數據庫收集到的信息進行解讀和分析， 患者臨床病理學參數與癌組織中PODXL mRNA 表達量的關系及強度采用χ2檢驗進行分析，計量資料以（±s）表達，為比較ccRCC 和配對的癌旁正常組織中PODXL mRNA 表達量的不同采用配對t檢驗。 采用Kaplan-Meier 描繪生存曲線圖，采用Log-rank 檢驗PODXL mRNA 表達量與患者生存狀況的關系。 使用單因素和多因素回歸分析PODXL mRNA 的表達量與患者臨床病理學參數關系及預后的影響，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PODXL mRNA 表達在ccRCC 中的診斷價值ROC 曲線分析結果顯示，PODXL mRNA 表達量對診斷ccRCC 具有潛在的診斷意義， 實驗者的ROC曲線下面積藥時曲線下面積（AUC） 為0.805，P=0.001，敏感性為67.26%，特異性為78.17%，95%CI為0.872～0.903。 見圖1。

圖1 PODXL mRNA 表達的ROC 曲線

2.2 GEPIA 分析PODXL mRNA 在癌旁組織中及ccRCC 組織中的差異 引用GEPIA 分析TCGA 來源的數據信息，包含ccRCC 組織526 例，其中包含72 例腎細胞癌旁正常組織。 PODXL mRNA 在ccRCC 組織中表達明顯高于正常組織。 見圖2。

圖2 TCGA 數據庫中PODXL mRNA 在ccRCC 組織與正常組織中的表達差異

2.3 ccRCC 組織中PODXL mRNA 的表達情況 數據庫中526 例樣本中ccRCC 組織和腎細胞癌旁正常組織中PODXL mRNA 表達差異很明顯[ccRCC組織：（6.42±1.42），ccRCC 癌旁正常組織：（3.61±1.31），P＜0.001]。 其中配對的72 例樣本中，ccRCC組織和配對癌旁正常組織中PODXL mRNA 表達差異也很明顯[ccRCC 組織：（6.55±1.23），配對癌旁正常 組 織：（3.53±1.35），P＜0.001]。 說 明PODXL mRNA 在ccRCC 組織中的表達量明顯比正常組織高。 見圖3。

圖3 ccRCC 組織中PODXL mRNA 的表達情況

2.4 PODXL mRNA 與ccRCC 患者臨床病理學參數的關系 PODXL mRNA 表達量因性別、病理分級、臨床分期、TNM 分期及遠處轉移不同均有差異（P＜0.001），與患者年齡、淋巴結轉移、腫瘤所在位置等因素相關性不大（P＞0.05），可以認為有遠處轉移、高級別、 臨床晚期及男性腎癌患者的PODXL mRNA 表達量較無轉移、低級別、臨床早期及女性腎癌患者高。 見表1。

表1 PODXL mRNA 表達與ccRCC 患者臨床病理學參數的關系[例（%）]

2.5 ccRCC 患者生存預后與PODXL mRNA 表達的關系 ccRCC 患者的總生存期與PODXL mRNA表達量明顯存在相關性， 表明PODXL mRNA 高表達組較低表達組的患者總體生存時間縮短明顯，數據庫526 例樣本中PODXL 低表達組和高表達組的總生存時間分別（1 446.75±956.32）d 和（1 253.81±939.57）d，差異有統計學意義：Log-rank=13.98，P＜0.001。見圖4。采用多因素和單因素回歸模型分析數據庫收集到的數據結果顯示，PODXL mRNA 的表達不能作為獨立預后指標： 單因素分析示HR=1.791，95%CI 為1.321～2.431，P＜0.001；多因素分析示HR=1.147，95%CI 為0.819～1.611，P=0.413。 該結果可能與樣本量較少有關， 需增加樣本數據進一步確定PODXL 的表達能否作為ccRCC 患者不良預后的獨立預后指標，其中患者的年齡、病理分級、臨床分期及是否存在遠處轉移等因素是能夠作為ccRCC 患者獨立預后指標的。 見表2。

圖4 ccRCC 患者生存預后與PODXL mRNA 表達的關系

表2 單因素與多因素分析ccRCC 患者臨床特征與患者生存預后關系

3 討論

RCC 在泌尿系惡性腫瘤中的發病率位居第二，僅次于膀胱癌，且發病率呈逐年上升趨勢，因腎臟解剖位置位于后腹膜，早期無明顯特征性表現，極少出現腹部包塊、 血尿、 腹痛等典型腎細胞癌臨床三聯征，當出現腎細胞癌三聯征時，多表示該患者已進入腎細胞癌晚期。 對于早期患者可通過根治性手術切除治療，晚期患者治療手段少，放化療效果及預后均較差。 相關文獻研究表明20%～30%的ccRCC 患者確診時已出現遠處轉移[4]。 尋找內分泌治療靶點已成為腎癌治療方法研究的一個新方向。

足細胞標志蛋白編碼在染色體7q32-q33 上，研究發現PODXL 在腎小球足細胞、血管內皮細胞、造血細胞和乳腺上皮細胞中呈高表達狀態[10～12]，PODXL 在一些腫瘤細胞的胞漿中表達， 但并不在細胞核中表達， 可向細胞膜突起[13]。 有文獻報道，PODXL 參與神經發育、 白細胞-內皮細胞相互作用、調節血管通透性和造血等多種生理過程[14～17]。 目前也發現PODXL 在泌尿系統中各種癌癥進展的有一定的臨床意義， 首次發現是PODXL 在睪丸癌中作為干細胞標記物[8]。 后來Casey Graham 等[19]研究發現PODXL 在前列腺癌組織中呈高表達， 可能是前列腺癌侵襲性的候選基因之一。Heath Elisabeth I[20]等研究發現PODXL 在前列腺腫瘤組織中的表達量和H-評分明顯升高， 使該蛋白成為前列腺癌可能的免疫組織化學標志物，這有助于對患者進行分級，從而獲得最佳治療。Boman K 等[21]研究發現PODXL的表達與腫瘤TNM 分期和高級別腫瘤顯著相關，PODXL 可能是尿路上皮性膀胱癌患者疾病進展和死亡的獨立危險因素。 另外PODXL 在其他系統癌癥也存在一定的臨床意義； 在消化系統方面，Borg David 等[22]研究發現PODXL 在食管癌和胃腺癌中的表達明顯高于正常上皮細胞， 通過未校正COX回歸分析證實，PODXL 在TTR 上的表達對預后有重要的意義，在校正模型中仍有顯著意義，且與淋巴結轉移和高級別腫瘤顯著相關。Taniuchi Keisuke 等[23]使用免疫印跡法在胰腺癌細胞表面和培養上清液中均可檢測到PODXL，PODXL 可能是一種新的、無創的胰腺癌診斷生物標志物。 然而，PODXL 基因與腎透明細胞癌疾病的關系目前在國內外尚未見報道， 故本研究通過檢索TCGA 數據庫信息， 探究PODXL 在ccRCC 的表達與臨床病理學參數及患者預后的相關性。

結果顯示， 數據庫中526 例ccRCC 樣本的PODXL 表達量比癌旁正常組織的表達量明顯更高，差異具有統計學意義，同時本研究通過ROC 曲線法分析發現，PODXL 基因可作為一個靈敏度和特異度較高的ccRCC 診斷指標， 其中AUC 為0.805，敏感性為67.26%，特異性為78.17%。 生存時間分析發現， 總體526 例樣本中PODXL 低表達者和高表達者的總體生存時間分別為（1 446.75±956.32）d 和（1 253.81±939.57）d，差異有統計學意義（Log-rank=13.98，P＜0.001）。 ccRCC 患者臨床病理學參數與PODXL 基因表達情況的關系顯示，PODXL 的表達因患者性別、 病理分級、TNM 分期、遠處轉移、 臨床分期不同均有顯著性差異，P＜0.001。 單因素和多因素回歸模型分析結果發現，ccRCC 患者年齡、病理分級、臨床分期及是否遠處轉移等可作為ccRCC 癌患者不良預后的獨立危險因素，而PODXL 的表達量不能作為ccRCC 不良預后的獨立危險因素（單因素分析示HR=1.791，95%CI 為1.321～2.431，P＜0.001； 多因素分析示HR=1.147，95%CI 為0.819～1.611，P=0.413），該結果可能與樣本量較少有關， 如需證明PODXL 的表達量能否可以作為ccRCC 患者不良預后的獨立危險因素，需增加樣本量研究加以證實。

綜上所述，通過挖掘公共數據庫TCGA 并分析發現，PODXL 基因與ccRCC 中高表達與臨床特征顯著相關，其高表達對判斷ccRCC 患者的生存預后及其診斷具有一定的參考價值。 為后續研究ccRCC抗腫瘤靶向治療提供了新的研究方向，PODXL 有可能成為一個新的抗癌治療靶點，可能改善ccRCC患者的預后。 雖然本研究已經初步證明PODXL 可能是一種新的ccRCC 診斷和預后標志物，但本研究也存在一些局限性， 所得結果均來自基因芯片數據庫， 主要的缺點是TCGA 數據庫只提供了PODXL在mRNA 水平上的表達， 這或許不能完全代表PODXL 在蛋白水平上的表達及活化程度。 目前PODXL 參與ccRCC 發生、發展的機制還不明確，也待于進一步研究。