FTY720 對卒中后抑郁大鼠單胺類神經遞質影響的實驗研究

王奕丹張 磊王建楠伍慧茹張 玲楊 洋隋汝波*

(1.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經內科,遼寧 錦州 121000； 2.錦州醫(yī)科大學護理學院,遼寧 錦州 121000)

PSD 是腦卒中后出現(xiàn)的一類情感障礙性疾病,增加了患者的致殘率及死亡率[1-2]。 然而,其發(fā)病機制尚不明,有多種學說并存[3],其中單胺類神經遞質學說最具代表性。 然而,目前單純補充單胺類神經遞質的藥物(如選擇性5-HT 再攝取抑制劑,SSRIs)對PSD 患者療效欠佳,且存在起效慢、毒副作用大、復發(fā)率高等問題[4],因此為PSD 尋找新的治療藥物勢在必行。

經臨床觀察發(fā)現(xiàn),患有風濕類疾病的PSD 患者在應用免疫抑制劑后可改善PSD 樣表現(xiàn)。 并且有研究顯示,卒中后激活的免疫炎癥反應使吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)和下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamo-pituitaryadrenal axis, HPA)過度表達[5],最終導致單胺類神經遞質的耗竭[6]。 因此可以猜測,抗炎可能會提高單胺類神經遞質的水平,進而改善PSD 樣表現(xiàn)。 為此本實驗選用免疫抑制劑FTY720 進行干預,采用行為學、分子學及基因學等實驗方法證實FTY720可改善PSD 大鼠的抑郁行為,提高單胺類神經遞質的水平。 本研究將為PSD 的治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠60 只,雄性,6 ～7 周齡,體重(200 ± 20)g,購自錦州醫(yī)科大學動物實驗中心[SCXK(遼)2017-0006]。 飼養(yǎng)于錦州醫(yī)科大學SPF 動物實驗中心[SYXK(遼)2019-0007]。 動物實驗研究由錦州醫(yī)科大學審批(IACUC 2019007),按照實驗動物使用的3R 原則予以人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

FTY720 源自美國Sigma 公司,CAS:162359-56-0；鹽酸氟西汀膠囊,禮來(蘇州)制藥有限公司,國藥準字J20170022；ELISA 檢測試劑盒(美國R&D 公司,5-HT 批號:L190408615,NE 批號:L190501419,DA 批號:L190402208)；酶標儀(批號:ELX-800,美國BIOTEK 公 司)； 熒 光 定 量 PCR 儀(批 號:Exicycler 96,韓國BIONEER 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及模型建立

大鼠適應性飼養(yǎng)1 周后行曠野實驗,選取評分相近的60 只大鼠隨機分為假手術組(n=10)和模型組(n=50)。 假手術組除頸總動脈不插入栓線外,余操作相同。 模型組大鼠參照Zealonga 線栓法[7]制備大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。 術后24 h 行Zealonga 神經行為學評分,選取評分1 ～3 分的大鼠入組[7-8]。 將MCAO 模型制備成功的大鼠再隨機分為卒中組(n=10)、PSD 組(n=10)、FLU 組(n=10)及聯(lián)合治療組(n=10)。 其中PSD 組、FLU 組及聯(lián)合治療組大鼠在MCAO 術后第3 天單籠飼養(yǎng)并加以Willner 等[9]和Katz 等[10]方法改良的慢性不可預知的溫和性刺激(CUMS),包括:①禁食禁水20 h；②禁水17 h；③潮濕墊料21 h；④45°傾斜鼠籠17 h；⑤行為限制2h；⑥持續(xù)照明17 h；⑦4℃冰浴游泳5 min；⑧水平震蕩鼠籠5 min；⑨夾尾1 min,每日隨機采取一種刺激方式,持續(xù)28 d。

1.3.2 給藥劑量及方法

治療組于慢性應激刺激第1 天時腹腔注射給藥。 FLU 組:鹽酸氟西汀溶液(5 mg/kg),聯(lián)合治療組:鹽酸氟西汀溶液(5 mg/kg)+FTY720(1 mg/kg)。假手術組、卒中組、PSD 組予等體積去離子水。

1.3.3 行為學指標測定

(1)曠野實驗:參照Papp 等方法[11]制黑壁白底80 cm×80 cm×50 cm 無蓋紙箱,底部分為25 個等格,將大鼠置于中央格內,待大鼠從中央格啟動后記錄,以穿越底面格數(shù)為水平運動得分,1 格計1分,以直立次數(shù)為垂直運動得分,動物雙足離開底面,無論站立多長時間直至雙足放下計1 分,每次記錄5 min。

(2)蔗糖水消耗實驗:參照Willner 等方法[9],實驗前訓練大鼠飲用1%蔗糖水。 大鼠禁食水20 h后,給予1 瓶1%蔗糖水和1 瓶蒸餾水,1 h 后取出,測定大鼠蔗糖水消耗量與總液體消耗量比值。

1.3.4 ELISA 法檢測大鼠海馬中5-HT、NE、DA含量

大鼠于末次行為學指標測定后斷頭取腦,冰上分離海馬組織,放入勻漿器中,加入生理鹽水在冰浴中磨成勻漿液,離心20 min 后取上清。 按ELISA試劑盒說明書操作,測定5-HT、NE、DA 含量。

1.3.5 Real-time PCR 法檢測大鼠海馬中TPH2mRNA、TH mRNA 的表達

取適量海馬組織根據(jù)試劑盒說明書提取樣本RNA,進行逆轉錄得到cDNA 樣本后用TPH、TH 的特異性引物進行熒光定量PCR 擴增,采用2-△△CT方法進行熒光定量分析。 引物序列見表1。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 進行分析。 計量資料符合正態(tài)性分布和方差齊性,不同組別間對比采用方差分析,同時分析時間和組別關系時采用重復測量方差分析,兩兩對比采用LSD-t檢驗,結果以平均數(shù)±標準差(±s)表示,以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 曠野實驗

(1)水平運動得分

第1 天時,造模的四組大鼠與假手術組大鼠相比水平運動次數(shù)減少(P＜0.05)。 第15、22、29 天時,與假手術組、卒中組比,PSD 組大鼠水平運動次數(shù)逐漸減少(P＜0.05)；與PSD 組比,FLU 組與聯(lián)合治療組大鼠水平運動次數(shù)顯著增加(P＜0.05)；二者組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(見表2)。

(2)垂直運動得分

第1 天時,造模的四組大鼠與假手術組大鼠相比垂直運動次數(shù)減少(P＜0.05)。 第15、22、29 天時,與假手術組、卒中組比較,PSD 組大鼠垂直運動次數(shù)明顯減少(P＜0.05)；與PSD 組比較,FLU 組與聯(lián)合治療組大鼠垂直運動次數(shù)增加(P＜0.05)；二者組間比較差異顯著(P＜0.05)(見表3)。

(3)中央格停留時間

第1 天時,各組大鼠中央格停留時間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。 第8、15、22、29 天時,與假手術組、卒中組比較,PSD 組大鼠中央格停留時間逐漸延長(P＜0.05)；與PSD 組比較,FLU 組與聯(lián)合治療組大鼠中央格停留時間縮短(P＜0.05)；二者組間比較差異顯著(P＜0.05)(見表4)。

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequence

表2 各組大鼠水平運動得分比較(±s, n=10)Table 2 Comparisons of horizontal movement scores of rats in each group

表2 各組大鼠水平運動得分比較(±s, n=10)Table 2 Comparisons of horizontal movement scores of rats in each group

注:與假手術組比較,*P＜0.05；與卒中組比較,#P＜0.05；與PSD 組比較,●P＜0.05；與FLU 組比較,△P＜0.05。Note. Compared with the sham operation group, *P＜0.05. Compared with the stroke group, #P＜0.05. Compared with the PSD group, ●P＜0.05.Compared with the FLU group, △P＜0.05.

組別Groups水平運動得分(分)Horizontal movement score(score)1 天1 d 8 天8 d 15 天15 d 22 天22 d 29 天29 d假手術組Sham operation group 45±4.4 50.3±5.79 63.2±6.09 68±4.67 72.1±6.01卒中組Stroke group 39.1±4.77* 48±5.46 60.3±3.77 65.8±5.61 70±5.25 PSD 組PSD group 38±4.32* 35.1±4.82*# 31.8±5.81*# 28.2±5.27*# 25±4.85*#氟西汀組Fluoxetine group 38.2±3.82* 44.8±2.53● 51.9±4.48● 57.7±5.93● 60.9±4.7●聯(lián)合治療組FLU+FTY720 group 38.1±4.51* 45.1±2.47● 56.5±3.14●△ 65±5.08●△ 67.1±4.86●△

2.2 蔗糖水消耗實驗

第1 天時,造模的四組大鼠與假手術組大鼠相比蔗糖水消耗比例降低(P＜0.05)。 第8、15、22、29天時,與假手術組、卒中組比較,PSD 組大鼠蔗糖水消耗比例明顯下降(P＜0.05)；與PSD 組比較,FLU組與聯(lián)合治療組大鼠蔗糖水消耗比例升高(P＜0.05)；二者組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(見表5)。

2.3 海馬中5-HT、NE、DA 含量

與假手術組、卒中組比較,PSD 組大鼠海馬中5-HT、NE、DA 的含量顯著降低(P＜0.05)；與PSD組比較,FLU 組與聯(lián)合治療組大鼠海馬中5-HT、NE、DA 的含量升高(P＜0.05)；二者組間比較差異顯著(P＜0.05)(見圖1)。

2.4 海馬中TPH2 mRNA、TH mRNA 表達

與假手術組、卒中組比較,PSD 組大鼠海馬中TPH2 mRNA、TH mRNA 的表達水平顯著降低(P＜0.05)；與PSD 組比較,FLU 組與聯(lián)合治療組大鼠海馬中TPH mRNA、TH mRNA 的表達量均升高(P＜0.05)；二者組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(見圖2)。

3 討論

PSD 是腦卒中后最常見的情緒障礙,是危害社會和公共衛(wèi)生的嚴重問題。 然而目前針對PSD 的治療藥物較少且具有局限性,因此為PSD 探索新的治療途徑至關重要。

表3 各組大鼠垂直運動得分比較( ±s, n=10)Table 3 Comparisons of vertical movement scores of rats in each group

表3 各組大鼠垂直運動得分比較( ±s, n=10)Table 3 Comparisons of vertical movement scores of rats in each group

注:與假手術組比較,*P＜0.05；與卒中組比較,#P＜0.05；與PSD 組比較,●P＜0.05；與FLU 組比較,△P＜0.05。Note. Compared with the sham operation group, *P＜0.05. Compared with the stroke group,#P ＜0.05. Compared with the PSD group, ●P ＜0.05.Compared with the FLU group, △P＜0.05.

組別Groups垂直運動得分(分)Vertical movement score(score)1 天1 d 8 天8 d 15 天15 d 22 天22 d 29 天29 d假手術組Sham operation group 12.1±3.73 14.1±3.64 16.1±2.92 17±2.79 18.1±3.84卒中組Stroke group 8.5±2.84* 13±3.3 14.9±3.25 15.6±3.1 16.1±2.69 PSD 組PSD group 8±1.94* 7.6±2.55*# 7±2.31*# 6±2.36*# 5.2±1.87*#氟西汀組Fluoxetine group 8.2±1.93* 11.1±1.91● 12±2.58● 12.5±2.59● 13.5±2.64●聯(lián)合治療組FLU+FTY720 group 8.1±2.03* 11.3±2.21● 14.5±1.43●△ 15.0±2.31●△ 16.4±3.72●△

表4 各組大鼠中央格停留時間比較( ±s, n=10)Table 4 Comparisons of central grid stay time of rats in each group

表4 各組大鼠中央格停留時間比較( ±s, n=10)Table 4 Comparisons of central grid stay time of rats in each group

注:與假手術組比較,*P＜0.05；與卒中組比較,#P＜0.05；與PSD 組比較,●P＜0.05；與FLU 組比較,△P＜0.05。Note. Compared with the sham operation group, *P＜0.05. Compared with the stroke group,#P ＜0.05. Compared with the PSD group, ●P ＜0.05.Compared with the FLU group, △P＜0.05.

組別Groups中央格停留時間(s)Central grid stay time 1 天1 d 8 天8 d 15 天15 d 22 天22 d 29 天29 d假手術組Sham operation group 0.81±0.47 1.02±0.36 1.81±0.4 4.52±0.56 5.5±0.77卒中組Stroke group 0.81±0.42 0.93±0.38 1.93±0.65 5.2±0.58 7±1.06 PSD 組PSD group 0.9±0.37 4.02±0.8*# 7.07±0.89*# 12.18±0.93*# 14.03±1.17*#氟西汀組Fluoxetine group 0.89±0.37 2.4±0.65● 4.5±0.78● 8.82±0.91● 11.05±1.11●聯(lián)合治療組FLU+FTY720 group 0.81±0.43 0.95±0.38●△ 2±0.65●△ 5.71±0.82●△ 8.5±0.97●△

表5 各組大鼠蔗糖水消耗比例比較( ±s, n=10)Table 5 Comparisons of volume ratio of sucrose water consumption of rats in each group

表5 各組大鼠蔗糖水消耗比例比較( ±s, n=10)Table 5 Comparisons of volume ratio of sucrose water consumption of rats in each group

注:與假手術組比較,*P＜0.05；與卒中組比較,#P＜0.05；與PSD 組比較,●P＜0.05；與FLU 組比較,△P＜0.05。Note. Compared with the sham operation group, *P＜0.05. Compared with the stroke group, #P＜0.05. Compared with the PSD group, ●P＜0.05.Compared with the FLU group, △P＜0.05.

組別Groups蔗糖水消耗比例(%)Volume ratio of sucrose water consumption 1 天1 d 8 天8 d 15 天15 d 22 天22 d 29 天29 d假手術組Sham operation group 66±13.78 69.6±10.56 75.3±12.53 84.3±15.71 89.7±15.9卒中組Stroke group 53.7±10.14* 63.3±13.38 69.6±12.15 79.5±14.85 83.7±14.24 PSD 組PSD group 52.5±11.94* 46.5±12.43*# 42.6±8.46*# 36.9±8.95*# 31.2±8.85*#氟西汀組Fluoxetine group 51±12.33* 57±10.77● 61.5±11.94● 65.4±14.82● 69±17.49●聯(lián)合治療組FLU+FTY720 group 54±13.42* 67.5±5.52●△ 72.3±11.53●△ 78±10.95●△ 82.5±13.87●△

注:與假手術組比較,*P＜0.05；與卒中組比較,#P＜0.05；與PSD 組比較,●P＜0.05；與FLU 組比較,△P＜0.05。圖1 大鼠海馬中單胺類神經遞質含量比較Note. Compared with the sham operation group, *P＜0.05. Compared with the stroke group, #P＜0.05. Compared with the PSD group, ●P＜0.05.Compared with the FLU group, △P＜0.05.Figure 1 Comparison of the content of monoamine neurotransmitters in the hippocampus of rats

注:與假手術組比較,*P＜0.05；與卒中組比較,#P＜0.05；與PSD 組比較,●P＜0.05；與FLU 組比較,△P＜0.05。圖2 大鼠海馬中單胺類神經遞質合成限速酶表達量比較Note. Compared with the sham operation group, *P ＜0.05. Compared with the stroke group, #P ＜0.05. Compared with the PSD group, ●P ＜0.05.Compared with the FLU group, △P＜0.05.Figure 2 Comparison of the expression levels of rate-limiting enzymes in the synthesis of monoamine neurotransmitters in the hippocampus of rats

本實驗在應用線栓法制備MCAO 模型的基礎上加用CUMS 法結合孤養(yǎng)法制備PSD 大鼠模型。 該模型的制備原理是鋸齒類動物經過CUMS 應激之后出現(xiàn)活動能力下降、興趣喪失、缺乏探索等一系列抑郁樣表現(xiàn)[12-13],較好的模擬了臨床上PSD 的核心癥狀。同時孤養(yǎng)法也模擬了病人患病后住院時的孤獨狀態(tài),因此該模型在PSD 的相關研究中廣泛應用[14]。

實驗大鼠模型的成功制備是相關行為學指標測定的前提。 曠野實驗水平運動反映大鼠的運動活動性水平；垂直運動反映大鼠對新鮮環(huán)境的好奇程度[15]；中央格停留時間反映大鼠啟動活動的潛伏期[16]；蔗糖水消耗實驗反映了大鼠對獎賞后的快感反應[17]。 本實驗結果顯示,與假手術組、卒中組比較,PSD 組大鼠曠野實驗得分及蔗糖水消耗比例明顯下降,提示PSD 模型造模成功。 與PSD 組比較,FLU 組及聯(lián)合治療組大鼠行為學得分升高,二者進一步比較發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組療效更顯著,證實FTY720可明顯改善PSD 大鼠的抑郁樣行為。 目前免疫抑制劑在治療PSD 方面的研究較少,有少量報道顯示FTY720 可以改善單純抑郁樣行為[18],PSD 作為一種特殊的抑郁類型,本實驗已證實FTY720 對PSD同樣具有確切的療效,為PSD 的治療提供新思路。

前文已證實FTY720 對PSD 大鼠的抑郁樣行為具有改善作用,本研究的另一核心是進一步觀察這種改善作用是否與單胺類神經遞質有關。 結果發(fā)現(xiàn),PSD 組大鼠海馬中5-HT、NE、DA 含量明顯降低,FLU 組與聯(lián)合治療組大鼠海馬中5-HT、NE、DA的含量升高,進一步比較發(fā)現(xiàn),聯(lián)合治療組大鼠海馬中5-HT、NE、DA 的含量升高更顯著, 證實FTY720 對PSD 大鼠行為學的改善作用是通過提高單胺類神經遞質水平實現(xiàn)的。 單胺類神經遞質是一類具有廣泛生物學活性的物質,其中5-HT、NE、DA 與抑郁癥關系最為密切。 目前有理論研究表明,卒中后中樞及外周發(fā)生的炎癥反應將繼發(fā)一系列改變[19-20],不僅過度激活IDO 酶,導致色氨酸(5-HT 的前體)被降解,分解成的喹啉酸及犬尿酸抑制DA 的釋放[21],而且會過度激活HPA 軸,使皮質醇過量分泌[5,22],進一步誘導降解酪氨酸(NE 的前體)[23]。 由此可見單胺類神經遞質減少的根源在于炎癥反應的激活,本次研究也通過動物實驗證實抗炎后可以提高單胺類神經遞質的含量,為上述理論研究提供了可行性。

為了進一步探究FTY720 提高單胺類神經遞質含量的機制,本次實驗還發(fā)現(xiàn)FTY720 可以調控單胺類神經遞質合成限速酶的表達。 結果提示,PSD組大鼠海馬中THP2 及TH mRNA 表達量顯著下降,與PSD 組比較,FLU 組及聯(lián)合治療組大鼠海馬中THP2 及TH mRNA 表達量升高,二者進一步比較發(fā)現(xiàn),聯(lián)合治療組大鼠海馬中THP2 及TH mRNA 表達升高更顯著。 TPH2 與TH 屬芳香族氨基酸羥化酶家族,分別負責5-HT 及兒茶酚胺類神經遞質(NE、DA)合成的最初步驟[24],是催化5-HT、NE、DA 合成的限速酶。 目前國內在FTY720 對單胺類神經遞質合成限速酶表達方面的作用尚無報道,本實驗證實了FTY720 在調控單胺類神經遞質合成限速酶表達方面的有效性,進而也證實了FTY720 可通過此途徑來提升單胺類神經遞質的水平。

綜上所述,FTY720 對PSD 大鼠的抑郁樣行為具有明顯改善作用,其作用機制為通過調控海馬組織中單胺類神經遞質合成限速酶的表達來提高單胺類神經遞質的水平,進而改達到治療效果。 本次研究不僅為PSD 的治療提供了新的方向,也為單胺類神經遞質學說提供了重要的補充。