花椰菜雪劍4號合子胚增殖體系的建立

許丁帆，劉艷軍*，丁鼎，季核亮，黃俊軒，武春霞，李建科

(1.天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300384；2.天津市耕耘種業(yè)股份有限公司，天津 300408)

花椰菜別名花菜、菜花，是十字花科蕓薹屬甘藍種的一個變種，營養(yǎng)價值高，風(fēng)味鮮美，適應(yīng)性廣，是我國廣泛種植的主要蔬菜之一[1]。我國是世界上花椰菜種植面積最大、總產(chǎn)最高、發(fā)展最快的國家[2]。花椰菜具有明顯的雜種優(yōu)勢，利用雜種優(yōu)勢是花椰菜育種的重要途徑之一[3]。生產(chǎn)上利用雜種優(yōu)勢已選育出較多的花椰菜，但人工雜交制種需要消耗大量的人力物力，嚴重阻礙花椰菜育種的發(fā)展。且雜交育種會受到季節(jié)氣候、母株材料等因素的影響，選育一個新品種往往需要6～8 a，育種周期較長[4]。

人工種子能夠快速固定雜種優(yōu)勢，大大縮短育種年限，使得優(yōu)良性狀快速得以應(yīng)用。我國在人工種子的研制和研究上取得了較快的進展，其研究主要集中在仙茅[5]、垂盆草[6]、杜鵑[7]、大花蕙蘭[8]等藥用植物和觀賞植物上，關(guān)于蔬菜人工種子的研究相對較少，蔬菜中胡蘿卜、芹菜、萵苣、姜等人工種子已有應(yīng)用[9]。關(guān)于花椰菜人工種子的研究少有報道，花椰菜人工種子的研制可省去人工去雄這一環(huán)節(jié)，快速固定F1代優(yōu)良性狀，且不受季節(jié)影響，能夠有效縮短花椰菜育種年限、降低人工成本，具有較強的應(yīng)用價值。制作人工種子的關(guān)鍵是人工種胚的研制，胚狀體、愈傷組織、不定芽等是人工種胚的理想材料[10]。本研究采用花椰菜成熟種子為外植體，直接誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體，并通過胚狀體增殖的方式獲得大量穩(wěn)定均一的胚狀體，為人工種子胚的研制奠定基礎(chǔ)，從而克服采用體細胞直接誘導(dǎo)胚狀體效率低和遺傳穩(wěn)定性差的缺點。

1 材料與方法

1.1 材料

供試花椰菜種子品種為雪劍4號，由天津市耕耘種業(yè)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 花椰菜種子的消毒

選取顆粒飽滿的花椰菜種子，用體積分數(shù)為70%的乙醇溶液潤濕種子表面，再用體積分數(shù)為40%的安替福民溶液消毒10 min，無菌水沖洗3次，每次沖洗5 min。沖洗后用無菌水浸泡2 h，備用。

1.2.2 花椰菜胚狀體的誘導(dǎo)

在無菌濾紙上，用解剖刀將種子表皮損害并刻傷子葉、下胚軸，分別接種到不同花椰菜胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的BA、2,4-D、NAA和蔗糖，采用7.0 g·L-1瓊脂粉固化，高壓滅菌前調(diào)節(jié)pH至5.8。每個處理接種5瓶，每瓶接種6粒種子，重復(fù)3次。

培養(yǎng)條件。于(24±2)℃條件下，采用相同培養(yǎng)基每15 d繼代培養(yǎng)1次，避光培養(yǎng)45 d，然后移至連續(xù)光照條件下培養(yǎng)，光照強度為2 000 lx，培養(yǎng)溫度不變，再經(jīng)2次繼代培養(yǎng)后(繼代周期15 d)，統(tǒng)計每種培養(yǎng)基上外植體的誘導(dǎo)情況。胚狀體的判斷采用顯微觀察及胚狀體萌發(fā)試驗的方法進行確定，即將誘導(dǎo)出的胚狀體放到MS培養(yǎng)基上，經(jīng)過短時間培養(yǎng)可很快獲得再生植株。

1.2.3 花椰菜胚狀體的增殖培養(yǎng)

誘導(dǎo)出的花椰菜胚狀體呈聚合塊狀，用鑷子將其分成約3 mm見方的顆粒，轉(zhuǎn)接到胚狀體增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加不同濃度配比的2,4-D與BA，附加7.0 g·L-1瓊脂粉、30.0 g·L-1蔗糖，pH值5.8。重復(fù)3次，每處理接種5瓶，每瓶接種5塊胚狀體顆粒。培養(yǎng)條件為連續(xù)光照，光照強度為2 000 Lx，培養(yǎng)溫度為(26±2)℃。處理每20 d繼代培養(yǎng)1次，60 d后統(tǒng)計每種增殖培養(yǎng)基獲得花椰菜胚狀體的生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚狀體誘導(dǎo)

將花椰菜種子刻傷后，經(jīng)過暗培養(yǎng)階段，部分種子吸水膨脹，有的種子子葉長出，有的種子下胚軸長出；將其轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)條件后，部分種子子葉或下胚軸附近出現(xiàn)小的凸起，再經(jīng)1次繼代培養(yǎng)，凸起增大，逐漸出現(xiàn)顆粒狀誘導(dǎo)物，經(jīng)鏡檢和萌發(fā)試驗確定部分培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)物為胚狀體。

由表1可知，當培養(yǎng)基中加入2.0 mg·L-1BA和2.0 mg·L-12，4-D時，僅能誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，且愈傷組織結(jié)構(gòu)松散，生長速度快，鏡檢觀察此類愈傷組織多為液泡較大的薄壁細胞，一般很難誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體；當培養(yǎng)基中加入4.0 mg·L-1BA和2.0 mg·L-12，4-D時，外植體表面產(chǎn)生質(zhì)地較硬、結(jié)構(gòu)緊密的綠色愈傷組織，鏡檢發(fā)現(xiàn)此類愈傷組織已經(jīng)組織化，內(nèi)部出現(xiàn)維管組織。不斷提高培養(yǎng)基中BA的濃度，當BA≤8.0 mg·L-1時，胚狀體誘導(dǎo)率隨著BA濃度的增加而提高，但胚狀體結(jié)構(gòu)緊密、生長速度較慢；當BA濃度>8.0 mg·L-1，胚狀體誘導(dǎo)率降低，且胚狀體玻璃化嚴重。為此，試驗在8.0 mg·L-1BA的基礎(chǔ)上附加了少量的NAA，誘導(dǎo)出的胚狀體結(jié)構(gòu)松散且生長速度較快，但此時胚狀體誘導(dǎo)率較低。為了獲得較高的胚狀體誘導(dǎo)率和高質(zhì)量的胚狀體，試驗調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透壓，當采用8%蔗糖時，花椰菜種子胚狀體誘導(dǎo)率顯著提高，達43.33%，同時胚狀體結(jié)構(gòu)松散、生長速度較快，在短時間內(nèi)生長穩(wěn)定。綜上試驗結(jié)果，選擇MS+8.0 mg·L-1BA+2.0 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-1NAA+8%蔗糖培養(yǎng)基，可獲得理想的花椰菜胚狀體。

表1 花椰菜在不同培養(yǎng)基上胚狀體誘導(dǎo)結(jié)果

2.2 球形胚繼代增殖培養(yǎng)

將誘導(dǎo)出的胚狀體繼代培養(yǎng)于MS+8.0 mg·L-1BA+2.0 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-1NAA+8%蔗糖上，胚狀體出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，且結(jié)構(gòu)緊密。為此，調(diào)整培養(yǎng)基激素與蔗糖濃度，在新的胚狀體增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，經(jīng)過2次繼代培養(yǎng)后不同培養(yǎng)基上胚狀體增殖情況明顯不同。

由表2可知，在培養(yǎng)基中單獨使用一定濃度BA時，花椰菜胚狀體結(jié)構(gòu)變得緊密，并隨著繼代次數(shù)的增加，胚狀體不再具備發(fā)育成苗的能力。當BA濃度為4.0 mg·L-1時，胚狀體玻璃化現(xiàn)象嚴重，最終褐化死亡。當在培養(yǎng)基中單獨使用2,4-D時，胚狀體上出現(xiàn)愈傷組織，并且隨著2,4-D濃度增加，愈傷組織生長速度加快，結(jié)合鏡檢觀察這些愈傷組織均為含大液泡的薄壁細胞。當培養(yǎng)基中BA與2,4-D混合使用時，情況變得較為復(fù)雜，這主要取決于二者的比值。當采用較高的BA/2,4-D比值時，胚狀體保持較好，并在適宜的濃度下可以穩(wěn)定增殖；當BA/2,4-D比值較低時，胚狀體不能增殖并逐漸喪失發(fā)育能力，逐漸轉(zhuǎn)變成愈傷組織。因此，選擇MS+4.0 mg·L-1BA+0.5 mg·L-12,4-D+3%蔗糖的培養(yǎng)基進行花椰菜胚狀體增殖的效果最好。

表2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對花椰菜胚狀體增殖的影響

3 討論

植物體胚發(fā)生主要有兩種途徑：一種為直接發(fā)生途徑，即直接在外植體上不經(jīng)愈傷組織階段形成胚狀體，其來源細胞可以是外植體表皮、亞表皮、合子胚等；另一種是在外植體上誘導(dǎo)胚性愈傷組織，再由胚性愈傷組織誘導(dǎo)胚狀體，即間接發(fā)生途徑[11-12]。通過不同體胚發(fā)生途徑獲得的胚狀體在遺傳穩(wěn)定性方面差異較大。一般間接發(fā)生途徑相對直接發(fā)生途徑容易，但直接發(fā)生途徑具有速度快、培養(yǎng)程序簡單的特點，同時還能避免間接發(fā)生途徑中由于經(jīng)愈傷組織階段體細胞無性系變異頻率較高的特點[13]。為此，本試驗選擇花椰菜成熟的合子胚為外植體，直接誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體。其主要優(yōu)勢為，花椰菜成熟種子本身含有一定數(shù)量的胚性細胞，相對于成熟組織細胞直接誘導(dǎo)胚狀體容易，其原因是胚性細胞實際沒有經(jīng)脫分化和再分化的環(huán)節(jié)，而是由胚性細胞直接發(fā)育成胚狀體。如果采用體細胞進行胚狀體的誘導(dǎo)，必須使得體細胞脫分化后再次轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚M織細胞，然后進一步發(fā)育成胚狀體，這一過程，受植物基因型、生理狀態(tài)等影響較大培養(yǎng)條件和營養(yǎng)供應(yīng)較難摸索；同時，采用合子胚為外植體直接誘導(dǎo)胚狀體，可避免細胞在脫分化與再分化過程中因使用大量外源激素，尤其是高濃度2，4-D的使用發(fā)生的遺傳變異。因此，選擇含胚性細胞的外植體以直接發(fā)生途徑獲得的胚狀體是人工種胚的理想材料。

人工種子胚的分割是人工種子制作的關(guān)鍵步驟之一，采用松散型的人工種胚可減少分割時造成的機械損傷，理想的人工種胚材料應(yīng)該是松散型的，而胚狀體增殖一般都會形成難以分離的較大顆粒，在制作人工種子胚時容易造成機械損傷，從而導(dǎo)致種子的出芽率下降現(xiàn)象。本試驗為誘導(dǎo)理想的松散型花椰菜人工種子胚，通過在培養(yǎng)基中加入少量2，4-D的方式，獲得結(jié)構(gòu)松散的胚狀體聚集團。但需要注意一定采用較低濃度的2，4-D。有研究表明，2，4-D易引起培養(yǎng)物發(fā)生染色體變異[14]。同時，試驗為獲得穩(wěn)定增殖且保持松散結(jié)構(gòu)的胚狀體，研究了不同BA與2，4-D比值對胚性材料增殖的主要影響。結(jié)果顯示，采用較高濃度BA和低濃度2，4-D對于胚狀體增殖培養(yǎng)較為理想。普遍認為，BA有利于胚狀體的增殖[15-16]，可維持細胞增殖的趨勢，是誘導(dǎo)胚狀體產(chǎn)生次生胚狀體的主要因素，這與初步誘導(dǎo)胚狀體時采用8.0 mg·L-1BA的原理相同，但持續(xù)高濃度的BA也會導(dǎo)致次生胚狀體生長速度過快，胚狀體老化嚴重，這時配合使用一定濃度的2，4-D，可適度減緩胚性增殖這一過程，使得次生胚在形成過程中容易產(chǎn)生外部皮層結(jié)構(gòu)，從而容易從母體上分離。

本試驗為獲得理想的花椰菜人工種子胚，選用花椰菜成熟種子為外植體，在高濃度BA和高濃度蔗糖配合使用條件下，獲得花椰菜初生胚狀體，然后再用含較高濃度BA與低濃度2，4-D的胚狀體增殖培養(yǎng)基，獲得了生長穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)松散的胚狀體培養(yǎng)體系，這對于花椰菜人工種子的研制具有重要意義，同時也為其他植物品種的人工種子的研制提供參考。關(guān)于花椰菜胚狀體同步化控制、萌發(fā)性試驗及其包埋與貯藏技術(shù)有待進一步研究。