洋蔥存儲中腐爛病菌鑒定

惠林沖，陳微，李威亞，楊海峰，何林玉，郇國磊，王江英，繆美華，陳振泰，潘美紅

(1.連云港市農業科學院 蔬菜研究室，江蘇 連云港 222000；2.江蘇省云臺農場有限公司，江蘇 連云港 222000)

洋蔥(AlliumcepaL.)是重要的園藝蔬菜之一，主要用于國內市場鮮食和脫皮保鮮加工出口。國內種植戶生產的洋蔥采收后直接銷售，均由經銷商、加工企業收購和存儲，種植戶很少會自留存儲。近幾年，在市場調查發現，洋蔥的存儲腐爛現象越來越重，尤其是全年加工洋蔥出口企業，因原料需要大量存儲，經常發生同一產區、不同品種集中腐爛的問題。種植戶、收購商會及時銷售，而常年洋蔥加工企業受損最嚴重。連云港海灣現代農業發展有限公司是江蘇最大的洋蔥加工出口企業，室外層架和低溫冷庫存儲均會發生腐爛。對加工企業而言，腐爛的洋蔥不能作為原料使用。篩選腐爛洋蔥除了肉眼觀察，Nishino等[1]開發了雙光束光譜測量，改進了洋蔥鱗莖內部腐爛的檢測方法，可以在早期篩選出腐爛的洋蔥，避免加工保鮮產品出口后出現腐爛現象。本研究對引起腐爛的主要病菌進行調查與鑒定，分析產生的原因，并提出相應對策，以期降低加工企業因洋蔥腐爛造成的損失。

1 材料與方法

1.1 材料

洋蔥品種與主要組培苗基本特征如下：連蔥12號(3B)，圓形，鱗莖球顏色為白色，晚熟品種，日照類型為中日照，來自連云港市農業科學院；950，圓形，鱗莖球顏色為紫色，晚熟品種，日照類型為中日照，來自連云港市農業科學院；GSH，圓形，鱗莖球顏色為黃色，晚熟，日照類型為長日照，由連云港海灣現代農業發展有限公司提供。用于黑粉菌侵染試驗組培苗3Y，扁形，鱗莖球顏色為黃色，中晚熟，日照類型為中日照，該品種為無蠟粉突變體，用鱗莖盤未經愈傷誘導直接出苗，由連云港市農業科學院提供。

1.2 方法

1.2.1 腐爛率與主要病原菌調查

洋蔥采收后分別在室外常溫和4 ℃低溫層架存儲，1個月后隨機選取上、中、下不同層數各500個洋蔥球，統計頸部、根部與內外部腐爛的個數，顯微觀察腐爛洋蔥病菌類型。

1.2.2 洋蔥黑霉菌分離與洋蔥組培苗侵染

從洋蔥外表鱗莖上取黑霉菌在MS培養基中培養，培養3 d后挑單菌落培養，然后挑取米粒大小黑霉菌的菌絲，接種洋蔥組培苗3Y。以未接種黑霉菌的組培苗為對照，每批次15瓶，重復3次，記錄觀察組培苗的生長情況。

1.2.3 洋蔥莖腐病分子鑒定

從頸部腐爛的洋蔥組織中分離出腐爛組織，液氮研磨。每個樣品3次重復。采用北京天根DP350-03-DNA試劑盒提取DNA。16S rDNA通用引物由蘇州金唯智生物有限公司合成，上游引物：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，下游引物：AAGGA GGTGATCCAGCCGCA。PCR擴增試劑購于TAKARA公司，反應體系25 μL：2 μL DNA(0.1 μg)，2.5 μL 10×PCR buffer，上游引物和下游引物分別1.25 μL，2 μL dNTPs(10 mmol·L-1)，0.20 μLTaq酶和15.80 mL ddH2O。PCR擴增條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min[2]。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠檢測，膠回收純化PCR產物，送蘇州金唯智生物有限公司測序，測序結果用NCBI數據庫進行比對分析。

2 結果與分析

2.1 洋蔥存儲中腐爛率與主要特征

洋蔥存儲過程中，常溫層架比4 ℃低溫層架存儲腐爛率高，可能是低溫降低了微生物的繁殖。中日照品種3B和950比長日照品種GSH的腐爛率低，GSH在低溫存儲中腐爛率依然高達20%(表1)。從腐爛的洋蔥表面觀察到，3B和950從外表鱗莖干枯裂開，直接能夠看到黑色的霉菌，沿著鱗莖紋路，由上端往下，由外表鱗莖向內表鱗莖感染，但大部分洋蔥表面均會出現黑霉菌，不至于引起整個洋蔥的腐爛(圖1中A、B)。GSH外部鱗莖無破裂，看起來無腐爛現象，手摸洋蔥頂部會發軟，有水流出，橫切面發現由頂部直接往洋蔥中心腐爛(圖1中C、D)。

表1 洋蔥存儲腐爛率與腐爛特征

A—950；B—3B；C、D—GSH。

2.2 洋蔥黑霉菌侵染組培苗

將從洋蔥表面分離的黑霉菌單菌落培養后，接種到洋蔥組培苗(3Y)中，20 d后黑霉菌長滿整個玻璃瓶，并感染洋蔥組培苗，洋蔥葉片上出現大量的黑霉菌孢子，而未接種的組培苗能夠正常生長(圖2)。

圖2 黑霉菌侵染洋蔥組培苗結果

2.3 洋蔥莖腐病分子鑒定

洋蔥頸部腐爛組織DNA經PCR擴增后獲得500 bp左右的條帶，測序結果顯示，獲得482 bp序列(圖3)。DNAMAN比對結果表明，3個樣品中的條帶序列一致性達99%，初步認為這3個樣品中的菌為同一種菌。將序列在NCBI數據庫中Blast比對后，發現其與真菌葡萄球菌(Botrytisaclada)的相似度達99%以上。因此，該菌被鑒定為葡萄球菌。

圖3 引起洋蔥莖腐病的葡萄球菌PCR擴增序列

3 小結與討論

洋蔥在存儲中引起腐爛的主要病菌為黑霉菌和葡萄球菌。對不同市場采后洋蔥調查發現，黑霉菌發生率最高[3]。通常在采收后能夠直觀地看到黑霉菌，加工企業在收儲時能夠較容易辨別；而且加工企業的產品大部分是脫去最外層鱗莖，因此，黑霉菌對加工產品影響不大。通風干燥的存儲條件和低溫干燥都能夠有效降低黑霉菌引起的腐爛率。

在加工企業存儲過程中，較嚴重的腐爛是由葡萄球菌引起的莖腐病[4-5]。本研究中，4 ℃低溫存儲的長日照品種GSH的腐爛率達到了20%。該品種的莖腐病具有隱蔽性，在嫩葉中，僅表皮細胞被感染，采收之前無任何肉眼可見的癥狀，到洋蔥球膨大后期，葉片開始倒伏干枯，葡萄球菌大量萌發，沿著洋蔥莖往下感染鱗莖，葡萄球菌在快枯黃葉子上形成棕灰色菌絲體，鱗莖上出現凹陷區域和灰棕色菌絲體。一般在洋蔥收獲后1～2月發生腐爛[6]。

洋蔥莖腐病的典型特征是從洋蔥球頂部往正中心腐爛，一旦發生病變，就無法作為保鮮出口產品原料使用。通過調查連云港海灣現代農業發展有限公司發現：洋蔥莖部腐爛情況近幾年比較嚴重，與收購的品種關系不大；存儲2個月，正常腐爛率在30%，有些批次洋蔥甚至達到90%以上。洋蔥莖腐病在田間無任何癥狀，種植戶無需用藥，采收后直接賣出，對種植戶無任何影響。造成洋蔥大面積莖腐病的原因與種植、采收方式有很大關系。磷肥可以提高洋蔥的耐貯性，氮肥可以降低洋蔥的耐貯性[7]。現在市售用于洋蔥種植的水溶肥比較多，在種植后期應停止灌溉；但為追求產量，種植戶在洋蔥倒伏期前后仍然使用水溶肥灌溉。采收方式也會加重莖腐病的發生。一般種植戶采收方式是現拔現裝袋、裝車，莖部傷口未愈合，加重了病菌的傳播。上述因素最終導致加工企業收購洋蔥后，存儲過程中發生莖腐病的比例非常高。

2018年8—11月通過調查比較洋蔥育種基地存儲的洋蔥和加工企業存儲的洋蔥發現，育種基地的洋蔥發生洋蔥莖腐病比例較低。育種基地采收的洋蔥要存儲越夏，秋季種植繁種用，為了降低腐爛率，在采收方式上先剪葉子后晾曬，傷口愈合后，下午或第2天才裝袋[8]，同時采收前2周停止氮肥的使用和大水漫灌，所以發生病害比較輕。為了降低加工企業洋蔥腐爛造成的損失，建議制定收購標準，有條件的企業發展自己原料生產基地，或與洋蔥主產區種植大戶或專業合作社合作，簽訂種植技術標準。控制室內存儲濕度，降低莖腐病的發生。科研育種單位開展相關抗病品種的研發，選育高產、優質、抗病、適合加工儲存的洋蔥專用品種。