甘薯基腐病病原菌分離鑒定及對甘薯品種的致病性測定

馮曉曉，許燎原，周小軍，鄭永利

(1.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站，浙江 杭州 310058；2.寧波市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，浙江 寧波 315012；3.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 金華 321017；4.浙江省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，浙江 杭州 310003)

甘薯(IpomoeabatatasL.)是旋花科甘薯屬的一個(gè)栽培種，又稱為番薯、白薯、紅薯、地瓜、山芋等，是我國的主要旱糧作物之一，也是重要的鮮食作物。隨著城鄉(xiāng)居民生活水平的提高，為適應(yīng)多元的消費(fèi)需求，高淀粉、高花青素、高胡蘿卜素、高蛋白等加工型和鮮食型甘薯品種廣泛種植。目前浙江省種植較廣的甘薯品種，如有加工粉絲性能佳的中晚熟品種浙薯13、早熟迷你型鮮食品種心香、加工和鮮食兼用型的甘薯品種浙薯77、高產(chǎn)品種浙薯38等。甘薯基腐病在1913年被Harter首次報(bào)道[1]，2016年蓋云鵬等[2]報(bào)道了浙江省三門縣的甘薯基腐病，2018年余繼華報(bào)道了浙江省臺州市的甘薯基腐病[3]。2018—2019年，作者在浙江省寧海縣的病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，收獲前期甘薯上有大量莖基部干腐褐化的病株，對甘薯產(chǎn)量造成毀滅性的影響。現(xiàn)將甘薯基腐病病原菌分離鑒定及對甘薯品種的致病性測定結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2017年8月1日在浙江省寧海縣進(jìn)行甘薯基腐樣品采集，樣品具有典型的莖基部黑褐色干腐、褐化干枯的發(fā)病植株。用鏟子從土壤中挖取帶有10 cm土壤和根系的病株，置于樣品袋中，于4 ℃保存。

1.2 病原菌分離純化

參考方中達(dá)《植病研究方法》[4]。挑取發(fā)病部位的黑色子實(shí)體(分生孢子器)置于無菌水中，將分生孢子洗下配成分生孢子懸液，將分生孢子懸液在含有50 mg·L-1氯霉素的PDA培養(yǎng)基平板劃線，于25 ℃下培養(yǎng)，挑取單菌落轉(zhuǎn)移至新的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，獲得純培養(yǎng)菌株。

1.3 病原菌形態(tài)鑒定

挑取病組織上的子實(shí)體，在顯微鏡下觀察分生孢子的形態(tài)；將純培養(yǎng)菌株ZJUP0002在PDA培養(yǎng)基上25 ℃恒溫培養(yǎng)7～30 d，觀察菌落形態(tài)。

1.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

1.4.1 基因組DNA提取

挖取PDA培養(yǎng)基上生長旺盛的純培養(yǎng)菌株ZJUP0002菌塊，置于2 mL離心管中，加入適量石英砂和DNA提取緩沖液，組織研磨儀60 Hz破碎120 s，9 000 r·min-1離心10 min，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，加入300 μL異丙醇沉淀DNA，上下顛倒數(shù)次，12 000 r·min-1離心10 min，去上清，加入0.8 mL 70%乙醇洗滌，12 000 r·min-1離心2 min，去上清，37 ℃溫育15 min，加入50 μL dd H2O，溶解基因組DNA。

1.4.2 PCR擴(kuò)增和測序

用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增ITS序列，PCR體系25 μL。PCR擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送至杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。

1.4.3 序列比對及分子生物學(xué)分析

將測序結(jié)果在NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列同源性比對，從數(shù)據(jù)庫下載相似度高的相應(yīng)序列，采用MEGA 6.0進(jìn)行多序列聯(lián)配，并采用IQTREE以最大似然法(maximum likelihood, ML)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，利用自展法(bootstrap)檢驗(yàn)各分支的支持率。

1.5 病原菌對不同品種甘薯的致病性測定

純培養(yǎng)菌株ZJUP0002在PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，過濾菌絲體，并用無菌水將菌絲體沖洗數(shù)次，重新懸浮在無菌水中，并將菌絲體打碎制備菌絲懸浮液。選取心香、浙薯13和浙薯77等3個(gè)甘薯品種的盆栽苗，將菌絲懸浮液接種至已培養(yǎng)30 d的健康甘薯莖基部土壤中，每盆接種10 mL，以清水為對照，觀察和記錄不同甘薯品種發(fā)病情況。發(fā)病后的植株再次用上述方法分離病原菌并進(jìn)行菌株鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)學(xué)特征

挑取發(fā)病部位的病原菌分生孢子器進(jìn)行鏡檢。由圖1可見，分生孢子單細(xì)胞，無色透明，橢圓形，兩端各有一個(gè)油球，大小6～9 μm×3～4 μm。純培養(yǎng)菌株ZJUP0002在PDA培養(yǎng)基上菌落呈不規(guī)則形，初白色，后變成灰白色至淺褐色，菌絲稀疏平鋪在培養(yǎng)基上，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d未見分生孢子器產(chǎn)生。在掃描電子顯微鏡下可見，菌絲束狀、有隔、多纏繞。

a為PDA培養(yǎng)30 d的菌落形態(tài)；b為病組織上的分生孢子；c為掃描電鏡下的菌絲。

2.2 病原菌對不同甘薯品種的致病性測定

甘薯基腐病在田間自然發(fā)病如圖2所示。以扦插法培育心香、浙薯13和浙薯77盆栽苗，在盆栽基質(zhì)接種病原菌菌絲懸浮液，每盆接種10 mL，以清水為對照，觀察和記錄不同甘薯品種發(fā)病情況。約14 d在莖基部出現(xiàn)褐化病斑，甘薯塊根變褐色，如圖2中c所示，上部分為發(fā)病的3個(gè)品種的塊根，下部分為對照的3個(gè)品種的塊根。發(fā)病植株生長緩慢并枯死(圖2中 d)，從左到右為心香、浙薯13和浙薯77，尤其是心香和浙薯13，基本全株死亡，相對而言，浙薯77抗性較好；而對照組依然生長正常。發(fā)病后的植株再次用上述方法分離病原菌，分離到的病原菌標(biāo)記為ZJUP0133，并進(jìn)行菌株鑒定。

a為田間自然發(fā)病，b為接種ZJUP0002的莖部組織出現(xiàn)褐色病斑，c為心香、浙薯13和浙薯77接種和對照的甘薯塊根對比圖，d為心香、浙薯13和浙薯77接種和對照的甘薯植株對比圖。

2.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定

對分離的菌株ZJUP0002和回接后分離的菌株ZJUP0133進(jìn)行ITS rDNA序列測定，序列用BLAST進(jìn)行同源性比對。基于ITS rDNA，利用MEGA 6.0對菌株ZJUP0002、ZJUP0133及GenBank已知的甘薯干腐病病原菌Diaporthebatatas代表性菌株進(jìn)行序列比對，以DiaporthellacorylinaCBS 121124為外群，IQTREE構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，從構(gòu)建的ML系統(tǒng)發(fā)育樹可以發(fā)現(xiàn)，病原菌ZJUP0002和回接后分離菌株ZJUP0133與Diaporthedestruens代表性菌株位于同一分支上，自舉支持率92%。因此，將ZJUP0002鑒定為甘薯基腐病菌Diaporthedestruens。

圖3 基于ITS的甘薯基腐病病原菌Diaporthe destruens ML系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

甘薯基腐病是制約甘薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的因素之一，該病易發(fā)生在甘薯收獲前夕，極大打擊了種植戶的信心，嚴(yán)重影響農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收入。在生產(chǎn)上，甘薯基腐病在品種之間存在抗病性差異。林飛榮等[5]于2017年對浙江省臺州市黃巖區(qū)上鄭鄉(xiāng)的30個(gè)甘薯品種發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，基腐病發(fā)病嚴(yán)重的品種病株率達(dá)90%，浙薯38等個(gè)別品種未發(fā)現(xiàn)病株，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗病性，可見品種之間抗病性差異極為顯著。作者在浙江省金華市調(diào)查發(fā)現(xiàn)，全市甘薯種植面積約5 333 hm2，甘薯基腐病從2013年開始陸續(xù)發(fā)生，至2020年發(fā)病面積約1 333 hm2，尤以婺城區(qū)塔石鄉(xiāng)發(fā)病較重，70%以上田塊有發(fā)病，減產(chǎn)30%～40%，嚴(yán)重地塊甚至絕收。大部分品種感病，浙薯38和浙薯255發(fā)病較輕。

本文通過分離甘薯基腐病病原菌，將病原菌接種至浙江省3個(gè)種植較廣的甘薯品種浙薯77、浙薯13和心香，3個(gè)甘薯品種均發(fā)生基腐癥狀。其中，浙薯13和心香發(fā)病較重，浙薯77具有較好的抗性，由此證明，不同品種甘薯對基腐病的抗性具有差異。因此，有必要對浙江省現(xiàn)有栽培的甘薯品種以及今后在品種選育中進(jìn)行甘薯基腐病的抗性鑒定，明確不同甘薯品種對基腐病的抗性。

甘薯基腐病的來源是種苗，可借助傷口侵染莖和塊根。在發(fā)病田塊，農(nóng)民常因甘薯無收成而任其在田間腐爛，病原菌在病殘?bào)w上飛快繁殖，在來年的種植中引發(fā)更重的病害。因此，在田間管理上，清園和避免連作顯得尤為重要。另外，林飛榮等[5]提出，采用無病種苗、土壤消毒和甘薯生長期噴藥預(yù)防對控制病害有顯著效果。噴藥與推遲扦插可延遲發(fā)病時(shí)間，選擇相對抗性較好的品種種植，是避免大面積發(fā)生甘薯基腐病的有效方法之一。