甘薯基腐病病原菌分離鑒定及對甘薯品種的致病性測定

馮曉曉，許燎原，周小軍，鄭永利

(1.浙江大學 農業試驗站，浙江 杭州 310058；2.寧波市農業技術推廣總站，浙江 寧波 315012；3.金華市農業科學研究院，浙江 金華 321017；4.浙江省農產品質量安全中心，浙江 杭州 310003)

甘薯(IpomoeabatatasL.)是旋花科甘薯屬的一個栽培種，又稱為番薯、白薯、紅薯、地瓜、山芋等，是我國的主要旱糧作物之一，也是重要的鮮食作物。隨著城鄉居民生活水平的提高，為適應多元的消費需求，高淀粉、高花青素、高胡蘿卜素、高蛋白等加工型和鮮食型甘薯品種廣泛種植。目前浙江省種植較廣的甘薯品種，如有加工粉絲性能佳的中晚熟品種浙薯13、早熟迷你型鮮食品種心香、加工和鮮食兼用型的甘薯品種浙薯77、高產品種浙薯38等。甘薯基腐病在1913年被Harter首次報道[1]，2016年蓋云鵬等[2]報道了浙江省三門縣的甘薯基腐病，2018年余繼華報道了浙江省臺州市的甘薯基腐病[3]。2018—2019年，作者在浙江省寧海縣的病害調查中發現，收獲前期甘薯上有大量莖基部干腐褐化的病株，對甘薯產量造成毀滅性的影響。現將甘薯基腐病病原菌分離鑒定及對甘薯品種的致病性測定結果總結如下。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2017年8月1日在浙江省寧?？h進行甘薯基腐樣品采集，樣品具有典型的莖基部黑褐色干腐、褐化干枯的發病植株。用鏟子從土壤中挖取帶有10 cm土壤和根系的病株，置于樣品袋中，于4 ℃保存。

1.2 病原菌分離純化

參考方中達《植病研究方法》[4]。挑取發病部位的黑色子實體(分生孢子器)置于無菌水中，將分生孢子洗下配成分生孢子懸液，將分生孢子懸液在含有50 mg·L-1氯霉素的PDA培養基平板劃線，于25 ℃下培養，挑取單菌落轉移至新的PDA培養基上進行純化，獲得純培養菌株。

1.3 病原菌形態鑒定

挑取病組織上的子實體，在顯微鏡下觀察分生孢子的形態；將純培養菌株ZJUP0002在PDA培養基上25 ℃恒溫培養7～30 d，觀察菌落形態。

1.4 病原菌分子生物學鑒定

1.4.1 基因組DNA提取

挖取PDA培養基上生長旺盛的純培養菌株ZJUP0002菌塊，置于2 mL離心管中，加入適量石英砂和DNA提取緩沖液，組織研磨儀60 Hz破碎120 s，9 000 r·min-1離心10 min，上清轉移至新的離心管，加入300 μL異丙醇沉淀DNA，上下顛倒數次，12 000 r·min-1離心10 min，去上清，加入0.8 mL 70%乙醇洗滌，12 000 r·min-1離心2 min，去上清，37 ℃溫育15 min，加入50 μL dd H2O，溶解基因組DNA。

1.4.2 PCR擴增和測序

用引物ITS1和ITS4擴增ITS序列，PCR體系25 μL。PCR擴增條件為95 ℃預變性2 min，95 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共35個循環，最后72 ℃延伸10 min。PCR產物送至杭州擎科梓熙生物技術有限公司測序。

1.4.3 序列比對及分子生物學分析

將測序結果在NCBI GenBank 數據庫進行序列同源性比對，從數據庫下載相似度高的相應序列，采用MEGA 6.0進行多序列聯配，并采用IQTREE以最大似然法(maximum likelihood, ML)進行系統發育分析，利用自展法(bootstrap)檢驗各分支的支持率。

1.5 病原菌對不同品種甘薯的致病性測定

純培養菌株ZJUP0002在PDB培養基中培養5 d，過濾菌絲體，并用無菌水將菌絲體沖洗數次，重新懸浮在無菌水中，并將菌絲體打碎制備菌絲懸浮液。選取心香、浙薯13和浙薯77等3個甘薯品種的盆栽苗，將菌絲懸浮液接種至已培養30 d的健康甘薯莖基部土壤中，每盆接種10 mL，以清水為對照，觀察和記錄不同甘薯品種發病情況。發病后的植株再次用上述方法分離病原菌并進行菌株鑒定。

2 結果與分析

2.1 病原菌形態學特征

挑取發病部位的病原菌分生孢子器進行鏡檢。由圖1可見，分生孢子單細胞，無色透明，橢圓形，兩端各有一個油球，大小6～9 μm×3～4 μm。純培養菌株ZJUP0002在PDA培養基上菌落呈不規則形，初白色，后變成灰白色至淺褐色，菌絲稀疏平鋪在培養基上，在PDA培養基上培養30 d未見分生孢子器產生。在掃描電子顯微鏡下可見，菌絲束狀、有隔、多纏繞。

a為PDA培養30 d的菌落形態；b為病組織上的分生孢子；c為掃描電鏡下的菌絲。

2.2 病原菌對不同甘薯品種的致病性測定

甘薯基腐病在田間自然發病如圖2所示。以扦插法培育心香、浙薯13和浙薯77盆栽苗，在盆栽基質接種病原菌菌絲懸浮液，每盆接種10 mL，以清水為對照，觀察和記錄不同甘薯品種發病情況。約14 d在莖基部出現褐化病斑，甘薯塊根變褐色，如圖2中c所示，上部分為發病的3個品種的塊根，下部分為對照的3個品種的塊根。發病植株生長緩慢并枯死(圖2中 d)，從左到右為心香、浙薯13和浙薯77，尤其是心香和浙薯13，基本全株死亡，相對而言，浙薯77抗性較好；而對照組依然生長正常。發病后的植株再次用上述方法分離病原菌，分離到的病原菌標記為ZJUP0133，并進行菌株鑒定。

a為田間自然發病，b為接種ZJUP0002的莖部組織出現褐色病斑，c為心香、浙薯13和浙薯77接種和對照的甘薯塊根對比圖，d為心香、浙薯13和浙薯77接種和對照的甘薯植株對比圖。

2.3 病原菌分子生物學鑒定

對分離的菌株ZJUP0002和回接后分離的菌株ZJUP0133進行ITS rDNA序列測定，序列用BLAST進行同源性比對。基于ITS rDNA，利用MEGA 6.0對菌株ZJUP0002、ZJUP0133及GenBank已知的甘薯干腐病病原菌Diaporthebatatas代表性菌株進行序列比對，以DiaporthellacorylinaCBS 121124為外群，IQTREE構建ML系統發育樹(圖3)，從構建的ML系統發育樹可以發現，病原菌ZJUP0002和回接后分離菌株ZJUP0133與Diaporthedestruens代表性菌株位于同一分支上，自舉支持率92%。因此，將ZJUP0002鑒定為甘薯基腐病菌Diaporthedestruens。

圖3 基于ITS的甘薯基腐病病原菌Diaporthe destruens ML系統發育樹

3 討論

甘薯基腐病是制約甘薯產業發展的因素之一，該病易發生在甘薯收獲前夕，極大打擊了種植戶的信心，嚴重影響農民的經濟收入。在生產上，甘薯基腐病在品種之間存在抗病性差異。林飛榮等[5]于2017年對浙江省臺州市黃巖區上鄭鄉的30個甘薯品種發病情況進行調查發現，基腐病發病嚴重的品種病株率達90%，浙薯38等個別品種未發現病株，表現出較強的抗病性，可見品種之間抗病性差異極為顯著。作者在浙江省金華市調查發現，全市甘薯種植面積約5 333 hm2，甘薯基腐病從2013年開始陸續發生，至2020年發病面積約1 333 hm2，尤以婺城區塔石鄉發病較重，70%以上田塊有發病，減產30%～40%，嚴重地塊甚至絕收。大部分品種感病，浙薯38和浙薯255發病較輕。

本文通過分離甘薯基腐病病原菌，將病原菌接種至浙江省3個種植較廣的甘薯品種浙薯77、浙薯13和心香，3個甘薯品種均發生基腐癥狀。其中，浙薯13和心香發病較重，浙薯77具有較好的抗性，由此證明，不同品種甘薯對基腐病的抗性具有差異。因此，有必要對浙江省現有栽培的甘薯品種以及今后在品種選育中進行甘薯基腐病的抗性鑒定，明確不同甘薯品種對基腐病的抗性。

甘薯基腐病的來源是種苗，可借助傷口侵染莖和塊根。在發病田塊，農民常因甘薯無收成而任其在田間腐爛，病原菌在病殘體上飛快繁殖，在來年的種植中引發更重的病害。因此，在田間管理上，清園和避免連作顯得尤為重要。另外，林飛榮等[5]提出，采用無病種苗、土壤消毒和甘薯生長期噴藥預防對控制病害有顯著效果。噴藥與推遲扦插可延遲發病時間，選擇相對抗性較好的品種種植，是避免大面積發生甘薯基腐病的有效方法之一。