生物轉(zhuǎn)化法提高木糖醇產(chǎn)量的發(fā)酵條件優(yōu)化

陳雪松，楊勝利

(1.浙江樹(shù)人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310015；2.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

傳統(tǒng)木糖醇生產(chǎn)工藝是以玉米芯為原料，經(jīng)過(guò)酸水解等預(yù)處理，產(chǎn)生木糖，采用加氫催化技術(shù)制備木糖醇。該工藝產(chǎn)量較低，能耗大，污染嚴(yán)重且生產(chǎn)成本高。此外，鎳催化劑會(huì)污染環(huán)境，嚴(yán)重制約企業(yè)發(fā)展和國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力。而采用微生物發(fā)酵半纖維素水解液生產(chǎn)木糖醇，具有反應(yīng)條件溫和、低能耗、相對(duì)環(huán)境污染程度小、產(chǎn)品質(zhì)量安全可靠的優(yōu)點(diǎn)[1-5]。

柑橘皮渣尚未得到好的開(kāi)發(fā)利用，基本上任其腐爛，化為塵土肥料。也曾有人從柑橘皮渣提取精油、果膠、色素、黃酮、檸檬苦素和膳食纖維等，但都未形成規(guī)模生產(chǎn)。柑橘皮渣富含半纖維素，用其做原料生產(chǎn)木糖乃至木糖醇，成本低廉，目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。并且柑橘皮渣中的木聚糖結(jié)合不如玉米芯牢固，容易水解得到木糖。本研究以實(shí)驗(yàn)室保藏的轉(zhuǎn)化木糖醇的Y-3號(hào)菌株為實(shí)驗(yàn)菌株，對(duì)木糖轉(zhuǎn)化發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種來(lái)自實(shí)驗(yàn)室保藏的Y-3號(hào)菌株。

活化培養(yǎng)基：酵母膏5 g·L-1，磷酸二氫鉀2 g·L-1，D-木糖20 g·L-1，二水氯化鈣0.1 g·L-1，硫酸銨5 g·L-1，七水硫酸鎂0.2 g·L-1，瓊脂20 g·L-1。

種子保藏培養(yǎng)基：酵母膏5 g·L-1，磷酸二氫鉀2 g·L-1，D-木糖20 g·L-1，二水氯化鈣0.1 g·L-1，硫酸銨5 g·L-1，七水硫酸鎂0.2 g·L-1，瓊脂20 g·L-1。

發(fā)酵培養(yǎng)基：柑橘皮水解液(木糖含量20 g·L-1)，酵母粉10 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1。

滅菌條件：木糖與其他營(yíng)養(yǎng)成分分開(kāi)滅菌，條件為121 ℃，20 min。

1.2 方法

1.2.1 柑橘皮水解液的制備

柑橘皮選自溫州蜜柑皮，將蜜柑皮烘干后，用電動(dòng)粉碎器粉碎，粉碎粒度100目，半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.9%。

柑橘皮半纖維素水解。柑橘皮粉末以1∶7(質(zhì)量∶體積)的固液比與質(zhì)量濃度1.0%硫酸混合，121 ℃下水解1 h。

濃縮。水解液離心濾去殘?jiān)螅?0 ℃真空濃縮，至總還原糖約為20%。

中和。水解液用NaOH中和至pH 10.0，4 000 r·min-1離心20 min去除沉淀。上清液用濃硫酸回調(diào)至pH 5.5，冷藏備用。

1.2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

發(fā)酵條件的優(yōu)化，具體是對(duì)裝液量、接種量、水解液的pH、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，依次求得最優(yōu)培養(yǎng)條件。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)每個(gè)變量做3個(gè)平行樣，以木糖轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，確定最優(yōu)條件。

1.2.3 測(cè)定方法

取待測(cè)樣品10 mL，3 000 r·min-1離心10 min，將上清液適當(dāng)稀釋。在25 mL大試管中加入1 mL稀釋的上清液和3 mL的DNS試劑，充分混合，沸水浴中反應(yīng)5 min，冷卻，定容至25 mL。在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)量吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出樣品木糖濃度[6]。

使用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定木糖醇的含量[7]。取適量發(fā)酵液，4 500 r·min-1離心15 min，將上清液適當(dāng)稀釋。取1 mL稀釋液于小試管中，加入1 mL試劑a，混勻后在室溫下反應(yīng)10 min，再分別加入2 mL試劑b和4 mL的NaSH試劑，混合均勻后在53 ℃水浴中保溫15 min，冷卻后于412 nm處測(cè)定吸光度值。試劑a：將0.320 g高碘酸鉀溶于100 mL 1%的鹽酸中；試劑b：配置鼠李糖1.11 g·L-1；NaSH試劑(需現(xiàn)配現(xiàn)用)：在100 mL 150 g·L-1的乙酸銨中，分別加入0.2 mL的乙酸及乙酰丙酮。

2 結(jié)果與分析

2.1 木糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

木糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 木糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 木糖醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線

木糖醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 木糖醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵效果的影響

木糖及木糖醇轉(zhuǎn)化率的影響因素比較多，其中溶解氧是關(guān)鍵其一[8]，菌體生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的積累取決于溶解氧的多少。通常發(fā)酵液溶氧量的改變是通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速來(lái)實(shí)現(xiàn)的。對(duì)木糖醇產(chǎn)生的代謝網(wǎng)絡(luò)分析看出，在木糖還原酶(XR)的催化作用下，以NADPH為輔酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)生木糖醇，此過(guò)程不需要氧的參與。而代謝過(guò)程在需氧狀態(tài)下[9]，木糖醇會(huì)進(jìn)一步在木糖醇脫氫酶(XDH)的催化下氧化生成木酮糖，更多的文獻(xiàn)表明微耗氧環(huán)境對(duì)木糖醇的積累是有利的。因而，實(shí)驗(yàn)設(shè)置了100、120、140、160和180 r·min-1的低轉(zhuǎn)速，以研究其生物轉(zhuǎn)化木糖醇情況(表1)。

表1 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵效果的影響

由表1可知，隨著轉(zhuǎn)速不斷增大，酵母菌轉(zhuǎn)化木糖醇的量也隨之增加，但是幅度并不明顯，在轉(zhuǎn)速為140 r·min-1時(shí)，木糖轉(zhuǎn)化率最高為54.4%。再增大轉(zhuǎn)速影響不大，主要原因是增大轉(zhuǎn)速使得溶解氧量增加，在發(fā)酵前期更加有利于酵母菌的繁殖。因此，當(dāng)轉(zhuǎn)速為140 r·min-1時(shí)已經(jīng)能夠滿(mǎn)足溶氧要求，達(dá)到酵母生長(zhǎng)的目的。

2.3.2 裝液量對(duì)發(fā)酵效果的影響

搖瓶發(fā)酵過(guò)程中裝液量的控制非常關(guān)鍵。在轉(zhuǎn)速不變的情況下，搖瓶裝液量決定了水解液溶解氧的濃度[10]。模擬好氧、缺氧以及厭氧條件的表征是通過(guò)裝液量來(lái)實(shí)現(xiàn)的。影響發(fā)酵反應(yīng)產(chǎn)物積累的重要條件是曝氣量，通常氧氣充分的狀態(tài)下不會(huì)產(chǎn)生木糖醇，在嚴(yán)格厭氧的狀態(tài)下菌體不能利用木糖進(jìn)行發(fā)酵。

在250 mL的錐形瓶里，實(shí)驗(yàn)設(shè)置了20、40、60、80 mL的裝液量，研究其發(fā)酵情況(表2)。

表2 裝液量對(duì)發(fā)酵效果的影響

由表2可知，在裝液量為40～60 mL時(shí)發(fā)酵效果最好，木糖轉(zhuǎn)化率超過(guò)55%。此時(shí)酵母菌發(fā)酵所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足，體系傳質(zhì)效果好，且提供了足夠的溶氧和養(yǎng)分供酵母菌進(jìn)行繁殖。

2.3.3 溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響

溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)繁殖和代謝產(chǎn)物積累是至關(guān)重要的，溫度通過(guò)對(duì)菌種體內(nèi)酶的改變來(lái)影響微生物的發(fā)酵狀態(tài)。偏低或者偏高的溫度會(huì)影響代謝產(chǎn)物的積累，是由于溫度會(huì)影響菌體內(nèi)酶活性、氧氣和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳質(zhì)速率。在最適溫度情況下，有利于菌種體內(nèi)酶的生長(zhǎng)、發(fā)酵和轉(zhuǎn)化，并處于最佳活性狀態(tài)。偏離這個(gè)溫度，過(guò)低會(huì)使酶的活性降低，過(guò)高可能導(dǎo)致酶變性失活。因而基于酵母菌生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物積累的特性，實(shí)驗(yàn)設(shè)置了25、30、35、40 ℃ 4個(gè)溫度變量，以研究其木糖醇轉(zhuǎn)化情況。

由表3可知，隨著溫度升高，酵母菌所產(chǎn)生的木糖醇也隨之增加，在30 ℃達(dá)到最大的木糖轉(zhuǎn)化率57.7%，超過(guò)35 ℃時(shí)轉(zhuǎn)化率反而下降，達(dá)到40 ℃時(shí)轉(zhuǎn)化率很低，只有42.4%，這可能與菌體內(nèi)參與代謝的酶活性受溫度影響有關(guān)。

表3 溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響

2.3.4 接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響

接種量是指投加種子液的體積和接種后培養(yǎng)液體積的比值。菌種在發(fā)酵液中生長(zhǎng)繁殖的速度由接種量的多少?zèng)Q定，增加接種量可以縮短發(fā)酵中菌絲繁殖達(dá)到高峰的時(shí)間，提前形成產(chǎn)物，并能大大削弱雜菌的生長(zhǎng)機(jī)會(huì)。但投加的接種量過(guò)多或者過(guò)少，都會(huì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生影響。對(duì)于接種量的優(yōu)化，主要考慮菌體與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物的關(guān)系，接種量過(guò)少延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。過(guò)多則會(huì)消耗過(guò)多底物用于菌體生長(zhǎng)，并且可能引起溶氧不足，過(guò)多移入代謝廢物，對(duì)木糖醇積累不利，且成本過(guò)高[11]。適宜的接種量，菌體在發(fā)酵液中生長(zhǎng)旺盛，同時(shí)營(yíng)養(yǎng)成分不會(huì)過(guò)分消耗，能夠正常累積代謝產(chǎn)物。因此，實(shí)驗(yàn)設(shè)置了4%、6%、8%、10% 4個(gè)接種量變量，以研究其木糖醇轉(zhuǎn)化情況。

由表4可知，木糖醇的轉(zhuǎn)化率受接種量影響也較大，隨著接種量的增大，在6%的接種量木糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值61.5%，再增加接種量木糖轉(zhuǎn)化率反而降低，可能是由于菌體的增多導(dǎo)致其代謝廢物積累也多，影響發(fā)酵。

表4 菌體接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響

2.3.5 起始pH對(duì)發(fā)酵效果的影響

pH在菌體發(fā)酵過(guò)程中，影響著菌體的生長(zhǎng)繁殖和代謝途徑，適宜的pH范圍能促進(jìn)微生物代謝產(chǎn)物的積累，是菌體新陳代謝活動(dòng)的重要影響因素。各種菌種在轉(zhuǎn)化木糖醇時(shí)最佳pH值不同，本實(shí)驗(yàn)選用的Y-3菌種在pH呈酸性條件下生長(zhǎng)繁殖非常旺盛。很多研究者報(bào)道酵母轉(zhuǎn)化木糖產(chǎn)生木糖醇的最適宜pH為4.0～6.0[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 pH變量，以研究其木糖醇轉(zhuǎn)化情況。當(dāng)pH為4～6時(shí)菌株具備了木糖醇轉(zhuǎn)化能力，并具有一定的正相關(guān)性，其中在pH為5.5時(shí)有最高的轉(zhuǎn)化率，達(dá)到64.4%(表5)。

表5 起始pH對(duì)發(fā)酵效果的影響

3 小結(jié)

產(chǎn)木糖醇Y-3號(hào)菌株的優(yōu)化發(fā)酵條件：轉(zhuǎn)速140 r·min-1，裝液量為60 mL，適宜溫度30 ℃，最佳接種量為6%，起始pH 5.5。優(yōu)化后實(shí)驗(yàn)測(cè)得木糖醇濃度為11.5 mg·mL-1，木糖轉(zhuǎn)化率為64.4%，較未優(yōu)化時(shí)的木糖轉(zhuǎn)化率提高。