申嗪霉素-纈氨酸耦合物在小麥植株上的傳導性研究

董 倩 ，趙熾娜 ，李俊凱 ，b

（長江大學，a.農學院；b.農藥研究所，湖北 荊州 434025）

殺菌劑在植物病害防治過程中發揮了重要作用，特別是內吸性殺菌劑的出現對植物維管束病害和根部病害的防治發揮了至關重要的作用。內吸性殺菌劑的使用可以減少農藥殘留量，減少環境污染，并在一定程度上增強藥效［1，2］。但目前國內外研制的大多數內吸性殺菌劑只能在植物質外體移動，如苯并咪唑類、哌嗪類等殺菌劑都只能通過根部吸收在植物體內從下往上運輸，而無法通過葉面噴施來防治根部和維管束病害［3］。如果殺菌劑能通過莖葉噴霧后，經植物韌皮部向下傳導來防治維管束病害和根部病害，不僅能有效防治此類病害，而且可以大大減少農藥用量，降低勞動成本，減輕環境污染，但截至目前能通過韌皮部向下傳導的殺菌劑數量相當有限。因此，研究和開發能通過植物韌皮部傳導的新型內吸性殺菌劑對提高農藥使用效率具有重要意義。

為了改善殺菌劑在植物韌皮部的傳導性，李俊凱等［4］將在植物體內具有向基性傳導的吲哚乙酸與不能向基性傳導的化學殺菌劑三唑醇化合后施用于大豆植株的葉片，發現該化合物能向基傳導至植株的根部。和拌種靈相比，拌種靈-丙氨酸耦合物能更迅速進入懸浮培養的大豆細胞，說明丙氨酸官能團可能會引導該衍生物通過主動吸收的方式進入植物細胞［5］。另外，以韌皮部傳導的水楊酸與殺菌劑拼接后還具有增效的作用［6］。2019 年，Xiong 等［7］在申嗪霉素-氨基酸耦合物的氨基酸氮原子上引入不同取代基，發現所得到的化合物一定程度上保留了其傳導性；另一方面，保留申嗪霉素分子結構中的羧基，而在申嗪霉素吩嗪環的7 號位引入氨基酸官能團，顯著增加了這些化合物在韌皮部的傳導性，暗示了氨基酸與申嗪霉素耦合物的傳導性與耦合位點具有十分重要的關系［7］。這些研究都說明了氨基酸引入到殺菌劑分子中后能一定程度上介導殺菌劑在植物韌皮部的傳導。申嗪霉素作為一種新型微生物源殺菌劑，主要用于防治水稻紋枯病、西瓜枯萎病、小麥赤霉病和辣椒疫病等多種植物病害，具有高效、低毒及環境相容性好的特點，但是不具備韌皮部輸導性，導致其使用方法和應用范圍有一定局限性［8-10］。在前期研究中，筆者所在研究團隊為了改善其韌皮部輸導性，將其與氨基酸進行耦合，得到了一系列的申嗪霉素-氨基酸耦合物，利用蓖麻幼苗模式植物進行室內傳導試驗，發現申嗪霉素-L-纈氨酸在眾多氨基酸耦合物中具有較優的韌皮部輸導性，且具有一定的殺菌活性［11］。但這種化合物在成熟作物上的傳導性和系統分布尚需進一步深入研究。本研究以申嗪霉素-纈氨酸耦合物為供試藥劑，以單子葉作物小麥（Triticum aestivumL.）為供試作物，深入研究其是否有由主莖向分蘗間傳導的特性及其在整株間的分布特性，以期為進一步探索氨基酸介導下農藥在作物中內吸傳導及韌皮部傳導的新型殺菌劑的研究與開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料 供試小麥為鄭麥9023（生長期：分蘗期），由河南省農業科學院小麥研究所提供。供試藥劑有申嗪霉素原藥（PCA，含量99.9%），由上海交通大學提供；申嗪霉素-L-纈氨酸耦合物（PCA-LVal）和申嗪霉素-D-纈氨酸耦合物（PCA-D-Val），由長江大學農藥研究所合成并提供。

供試儀器主要有Thermo UltiMate3000 TSQGuantis 超高效液相色譜-質譜聯用儀（LC-MS/MS型），美國賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scien?tific）；雙光束紫外可見分光光度計（TU-1901 型），北京普析通用儀器有限公司。

1.1.2 藥液配制 準確稱取一定量的PCA、PCA-LVal 和 PCA-D-Val 于 10 mL 容量瓶中，加入 1 mL 二甲基亞砜（DMSO）超聲溶解，添加2 滴滲透劑T、3 滴丙三醇和0.1% 的吐溫80 于容量瓶內，混合均勻后用去離子水稀釋至一定體積，使得最終藥劑濃度為200 μmol/L，待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試植物藥劑處理方法 每盆塑料盆缽裝有基質及沙土（體積比3∶1），小麥催芽后，種植在塑料盆缽中，平均每盆播種20 顆，播種后澆水使土壤徹底濕潤。將塑料盆缽置于溫室環境下培養，待小麥長至分蘗期時，用柔軟的毛筆在小麥主莖的所有葉片上分別均勻涂布200 μmol/L 的3 種供試藥劑，并設置清水對照，各處理重復3 次。

1.2.2 采樣處理 小麥分蘗期的取樣部位為主莖葉片、分蘗葉片、根部，取樣時間為處理后3、9、18、30、48 h。

1.2.3 小麥植株樣品的前處理方法 準確稱取小麥葉片樣品3.00 g，置于150 mL 磨口三角瓶中，加入50 mL 甲醇，于研缽中充分研磨，超聲提取30 min，抽濾，用甲醇分別超聲提取2 次，合并濾液；濾液過無水硫酸鈉漏斗除水后，旋轉濃縮至近干，待凈化。將濃縮提取液用少許二氯甲烷轉移至250 mL 分液漏斗中，加入50 mL 10%的氯化鈉水溶液和5 mL 1 mol/L 氫氧化鈉溶液，混勻后用二氯甲烷分2 次振蕩萃取；棄去二氯甲烷相，堿性水相用冰乙酸調節pH 至弱酸性，再用二氯甲烷振蕩萃取3 次，靜置至完全分層，收集二氯甲烷相，合并濾液，經無水硫酸鈉除水后，于旋轉蒸發儀上蒸干，用色譜甲醇溶解，使用氮吹儀定容至1.00 mL，過0.22 μm 濾膜，待測。

1.2.4 液相色譜與質譜條件 色譜條件：色譜柱為Hypersil-Gold-C18（100 mm×2.1 mm，5 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B）。梯度洗脫程序為0~2.0 min，95%A；2.0~6.0 min，95%~2%A；6.0~8.0 min，2% A；8.1~10.0 min，2%~95% A；流速為0.3 mL/min；進樣量10 μL。

質譜條件：離子源為電噴霧離子源（ESI）；掃描方式為正離子掃描；檢測方式為多反應監測。電噴霧電壓為3 500 V；離子化溫度為350 ℃；毛細管溫度為400 ℃，霧化氣和氣簾氣均為高純氮氣；碰撞氣為氬氣，碰撞氣壓力為0.2 Pa；鞘氣流速為30 L/min；輔助氣流速為5.0 L/min；PCA定量離子對225.1/207.0，碰撞能量26 V；定性離子對225.1/152.0，碰撞能量45 V。PCA-L-Val和PCA-D-Val選擇m/z324.1/207.0 作為定量離子對、m/z324.1/278.1作為定性離子對，碰撞能量45 V。

1.2.5 標準溶液的配制與標準曲線的繪制 準確稱取 PCA 純品 0.004 5 g、PCA-L-Val 和 PCA-D-Val 純品0.006 5 g，移至容量瓶中，用甲醇溶解定容至100 mL，搖勻，配制成200 μmol/L 標準溶液。將標準溶液用色譜甲醇稀釋配制0.031、0.310、1.500、3.000、6.000、15.000、25.000 μmol/L 的系列標準溶液，在選定的LC-MS/MS 檢測條件下測定。提取供試化合物的定量離子，以該定量離子的峰面積（Y）為縱坐標，相應PCA、PCA-L-Val 和 PCA-D-Val 的濃度（X，mg/L）為橫坐標繪制標準曲線，計算出相應的標準曲線方程式及相關系數。

2 結果與分析

2.1 標準曲線及添加回收率

申嗪霉素及其纈氨酸耦合物質譜與色譜結果分別如圖1、圖2、圖3 所示，添加回收率結果如表1 所示。結果表明，標準溶液中供試藥劑在選定的濃度范圍內與檢測峰面積呈線性關系，得到PCA 標準溶液的回歸線性方程式為y=2×106x-1 501.5，相關系數為0.999 9；PCA-L-Val 標準溶液的回歸線性方程式為y=1×106x-34 786，相關系數為0.999 6；PCAD-Val 標準溶液的回歸線性方程式為y=2×106x-21 363，相關系數為0.999 7。以上結果表明，申嗪霉素-纈氨酸耦合物標準溶液與其相對應的色譜峰面積選定的質量濃度范圍內線性關系良好，符合農藥殘留定量分析的標準。

表1 供試化合物在小麥葉、莖、根部基質中的添加回收率及相對標準偏差（n=5）

在0.150、1.500、3.000 μmol/L 3 個添加水平下進行添加回收試驗，結果（表1）表明，PCA 的平均回收率范圍為83.24%~89.72%，RSD（相對標準偏差）范圍為1.81%~4.97%；PCA-L-Val 的平均回收率范圍為 89.92%~94.21%，RSD范 圍 為 2.11%~11.51%；PCA-D-Val 的平均回收率范圍為89.25%~93.63%，RSD范圍為1.21%~5.18%。這表明該檢測方法可行，符合農藥殘留分析的要求。

2.2 供試化合物在分蘗期小麥植株中各部位的含量分布

使用濃度為200 μmol/L 的藥液葉面處理小麥主莖葉片后，采用LC-MS/MS 檢測小麥植株鮮樣中各部位供試化合物的含量，結果如表2 所示。結果表明，使用申嗪霉素-纈氨酸耦合物處理小麥主莖葉片后，在植株根部可檢測到相應化合物存在，而申嗪霉素處理小麥主莖葉片后在植株根部未檢測到其存在，說明申嗪霉素-纈氨酸耦合物具有在小麥植株韌皮部傳導的特性；其中，藥劑處理后3~48 h，PCAL-Val 在小麥根部中的含量隨著時間推移呈先增加后減少的趨勢，且在18 h 達到最大值，為15.50 μmol/kg，PCA-D-Val 也表現出同樣的變化趨勢，且在同一時刻達到最大值，為11.37 μmol/kg；總體而言，PCA-L-Val 在分蘗期小麥植株中的韌皮部傳導性強于PCA-D-Val。同時在小麥的分蘗葉片中也檢測到供試化合物的含量，但是經申嗪霉素處理小麥后在該植株分蘗葉片中未檢測到其含量，說明申嗪霉素-纈氨酸耦合物還具備了由主莖向分蘗間傳導的特性；其中，PCA-L-Val 葉面處理小麥3 h 后該化合物在分蘗中的含量達到最大值，為8.74 μmol/kg，而PCA-D-Val 在同一時刻也達到最大值，為4.54 μmol/kg，且二者隨著時間推移在小麥分蘗中的含量總體呈下降趨勢。以上結果表明，PCA-L-Val 在小麥上的這種傳導特性強于PCA-D-Val。

表2 不同時間下供試化合物處理分蘗期小麥后植株鮮樣中各部位含量

3 小結與討論

本研究結果表明，申嗪霉素-纈氨酸耦合物具有在小麥韌皮部傳導的特性，分蘗期小麥植株根部檢測到目標化合物含量最高可達15.50 μmol/kg，并且處理時間為3 h 時根部申嗪霉素-L-纈氨酸的檢測量與處理時間為48 h 時的檢測量接近，說明其能在根部穩定積累。更重要的是，還發現該耦合物在小麥分蘗期有從主莖向分蘗間傳導的特性，小麥植株分蘗中的纈氨酸耦合物含量最高可達8.74 μmol/kg。由此可知，與不具備韌皮部傳導性的申嗪霉素相比，纈氨酸的引入賦予了耦合物在小麥植株體內向下的傳導性，而且還具有從主莖向分蘗傳導的特性，此結果對開發具有植物韌皮部傳導能力的新型殺菌劑意義重大。

對比同一處理濃度下2 種構型的申嗪霉素-纈氨酸耦合物在小麥體內的含量分布情況，申嗪霉素-L-纈氨酸耦合物在分蘗上和根部的含量都明顯高于申嗪霉素-D-纈氨酸耦合物。D構型的纈氨酸耦合物在根部能檢測到的最大含量為11.37 μmol/kg，而L 構型的纈氨酸耦合物在根部能檢測到的最大含量為15.50 μmol/kg，說明L 構型纈氨酸的引入更有利于耦合物在小麥上內吸傳導性的提高，這也與YU等［11］在蓖麻上的研究相符合。本研究再次證實了不同構型的氨基酸引入對活性母體在作物中的內吸傳導性具有不同的影響。

在此前的研究中利用申嗪霉素-L-丙氨酸酯及其水解產物申嗪霉素-L-丙氨酸進行了蓖麻傳導性試驗，結果表明，申嗪霉素-L-丙氨酸酯不具備韌皮部傳導性，其水解產物申嗪霉素-L-丙氨酸卻具有韌皮部傳導性［12］。進一步分析認為，申嗪霉素-氨基酸酯類耦合物之所以不能傳導，可能是因為氨基酸酯耦合物并不能被氨基酸運輸載體所識別，將氨基酸羧基脫保護后則能夠被相應的載體識別、運輸并表現出在植物韌皮部優良的傳導性［3］。關于氨基酸與農藥耦合后形成的化合物在植物韌皮部中的傳導是否利用了氨基酸轉運載體的研究目前也有了一定的基礎。氨基酸轉運蛋白底物具有多樣性，它們作用下的藥物吸收在韌皮部的轉運是一個精細的過程，涉及錯綜復雜的機制。其中，AAPs 家族轉運蛋白對酸性和中性氨基酸轉運能力一般［13］，但是AtA?AP6 蛋白則對中性氨基酸和谷氨酰胺具有較高的親和力［14］；Ren 等［15］的研究表明，過表達擬南芥中的AtAAP1基因增加了根和原生質體對氯蟲苯甲酰胺-丙氨酸耦合物的吸收。Jiang 等［16］的研究表明，氟蟲腈-L-谷氨酰胺的攝取與氨基酸轉運體AtLHT1的表達之間存在直接的相關性。Chen 等［17］的研究表明，缺乏AtLHT1基因的幼苗無論是對氯蟲苯甲酰胺-甘氨酸耦合物的吸收還是從根到莖的轉運都表現出減少的趨勢。由于除了沒有立體構型的甘氨酸外，高等植物中幾乎所有的氨基酸都是L 型［18］。所以提出了以下推測：申嗪霉素-L 纈氨酸耦合物在小麥體內更容易被其相應的轉運蛋白所識別，另一方面，L 構型的纈氨酸轉運蛋白同樣可以識別D 構型的纈氨酸，但識別能力較低。因此，可以解釋在小麥體內檢測到申嗪霉素-L-纈氨酸耦合物的含量比申嗪霉素-D-纈氨酸耦合物的含量高。但是究竟申嗪霉素-纈氨酸耦合物的傳導性是否利用了小麥體內氨基酸轉運載體進行傳導，作為導向化合物的氨基酸種類和結構與耦合物的傳導性之間存在何種關系，作為導向化合物的氨基酸種類與載體的類型之間存在何種關系，這些關鍵問題仍需要進一步解決。