miRNA對水稻脅迫應答及產量調控影響的研究進展

于雅潔，李紹清

（武漢大學生命科學學院/雜交水稻國家重點實驗室，武漢 430072）

MicroRNA（miRNA）是長度為 20~24 nt 的一種內源性非編碼小分子RNA，在動植物體內都大量存在［1，2］。水稻（Oryza sativaL.）作為重要的糧食作物，為全球超過1/5 人口提供口糧，但各種生物及非生物脅迫均會對水稻質量及產量產生影響。因而如何提高水稻應對脅迫的能力，并提高水稻產量成為科學家們研究的重點。本研究論述了miRNA 在增加水稻產量和應對水稻脅迫方面的作用，以期為水稻種質資源挖掘和品種改良提供新的研究思路。

1 miRNA 的發現及作用機制

1.1 miRNA 的發現

1993 年，研究秀麗隱桿線蟲的生物學家在線蟲中發現了一種常見的21 個核苷酸的RNA 片段，將其命名為lin-4。lin-4抑制了核蛋白lin-14 的表達，通過該方式調節線蟲發育［3］。

2000 年，科學家在線蟲中又發現了一種small RNA。同lin-4類似的是，該small RNA 也可以通過結合一些靶基因mRNA的3′-UTR 而調節線蟲的發育，這種 small RNA 被命名為let-7［4］。

為了探究植物中是否存在miRNA，2002 年，遺傳學家從擬南芥中分離出了許多微小的RNA 片段，通過克隆所有在microRNA 大小范圍內的RNA 并分析了它們序列的某些特征，發現了16 個miRNA，并將其命名為miR156至miR171，這是首次在植物中發現 miRNA 的存在［5］。

近年來，隨著高通量測序技術逐漸成熟，已經從多種動植物中鑒定出38 589 條保守的或物種特異的miRNA［6，7］。 這 充 分 說 明 miRNA 研 究 領 域 快 速 發展，并從側面證明miRNA 廣泛參與動植物的生理生化過程。

1.2 miRNA 的作用機制

動植物細胞內的miRNA 均為短序列RNA，不會編碼蛋白質，并且都有很高的保守性［8］。動物和植物在miRNA 產生方式上存在差異，并且植物miR?NA 和動物miRNA 在進化上是獨立進行的，因此植物和動物的miRNA 在序列、前體以及成熟過程等方面都有所區別［9-11］。

動物miRNA 在進化上非常保守，線蟲體內55%的miRNA 都可以在人體內發現其同源物［12］。miR?NA 在動物中與靶基因 mRNA 的 3′UTR 區特異結合，從而引起mRNA 的降解或抑制蛋白的翻譯。其中miRNA 中心位點處與靶基因的結合允許一定數量的堿基錯配［13，14］。動物中大多數 miRNA 是 RNA 聚合酶Ⅱ轉錄的產物，但一些人類miRNA 已被證明是RNA 聚合酶Ⅲ活性的產物［13，15］。

植物miRNA 的合成過程十分精確，miRNA 與靶基因編碼區特定位點在植物中會以完全互補（或接近完全互補）的方式結合。通過切割靶基因的mRNA，植物 miRNA 對其進行調控［9］。

2 miRNA 對水稻生物脅迫的調控

全球1/5 的人口以稻米為主要糧食作物。雖然近幾十年來水稻產量持續增加，但伴隨著農藥的廣泛使用，水稻生產中病原菌耐藥性現象愈發嚴重，病害發生越來越頻繁，病原菌逐漸成為全球水稻生產的主要威脅之一，因此迫切需要提高水稻植株抵御有害微生物的能力，研究發現miRNA 可以從多種途徑調控水稻的生物脅迫響應，因而miRNA 成為水稻抗病的一個重要突破口。

2.1 miRNA 對水稻應對稻瘟病的調控

稻瘟病會對水稻產量產生很大的威脅，因而明晰稻瘟病的發病機制及采取有效的預防措施成為穩定水稻產量的重要措施之一。

OsmiR7695是第一個被發現的參與稻瘟病調控網絡的miRNA，通過負調控其靶基因OsNramp、OsmiR7695可以促進水稻對稻瘟病的抗性［16］。Li等［17］通過對正常條件下以及在稻瘟病感染時易感植株和抗性植株的小RNA 文庫進行深度測序，發現過表達OsmiR160a和OsmiR398b的轉基因水稻植株同樣表現出對稻瘟病的抗性增強。通過對感病植株和抗性植株的分析，Li 等［18］發現OsmiR169a的表達量在感病植株中明顯上升。并且NF-YA 的家族成員作為OsmiR169a的靶基因，其表達量在過表達OsmiR169a的植株中呈下降的趨勢。這一結果暗示著OsmiR169通過抑制NF-YA基因的表達從而在水稻對稻瘟病菌的免疫中起負調控作用。在水稻對稻瘟病的抵御中，ARF12基因同樣起到重要作用，ARF12是OsmiR167d的靶基因，在過表達OsmiR167d的植株中觀察到該基因的表達量降低，同時伴隨著植株對稻瘟病的抗性降低，因此OsmiR167d-ARF12調控模塊在提高水稻抗病性方面具有一定的應用價值［19］。作為抗稻瘟病的陽性因子，OsTCP21受OsmiR319b的調控。在過表達OsmiR319b的植株中，OsTCP21的表達量降低，而與OsTCP21表達相關的OsLOX2/5的表達量同樣呈降低的趨勢，最終導致植株對稻瘟病抗病性下降［20］。OsmiR396是水稻中十分重要的小RNA 家族之一，通過抑制多個不同Os?GRFs因子的表達，OsmiR396負調控水稻對稻瘟病的抗性，在過表達OsmiR396后，水稻對稻瘟病的抗性下降［21］。植物在防御稻瘟病中的一個有效方法是通過RNAi 系統識別和破壞病毒產生的RNA 分子，而這一過程依賴AGO 家族蛋白，其中就包括AGO1。而 Wu 等［22］發現，OsmiR168會負調控植物內AGO1 的表達，且在感病植株中觀察到OsmiR168的表達量上升，除了AGO1 之外，AGO18 可以通過與OsmiR168結合，降低其對AGO1 的影響，從而增強植株的抗病性。

2.2 miRNA 對水稻應對條紋葉枯病的調控

在水稻的常見病害中，條紋葉枯病會對水稻產量造成嚴重的威脅，因而控制水稻條紋葉枯病的發病也是現階段科學家們需要攻克的難題之一。

在水稻中，通過抑制OsmiR171b的表達，Tong等［23］發現水稻表現出葉片發育遲緩且葉綠素含量降低的癥狀，而這一癥狀與水稻感染條紋葉枯病的癥狀相似。過表達OsmiR171b的水稻中對條紋葉枯病的敏感性降低，且條紋葉枯病的癥狀減輕。Wang等［24］發現OsmiR444是 影 響抗 病 毒 信 號 傳遞 到OsRDR1的關鍵因素，水稻在被病毒感染后體內Os?miR444的表達增強。隨后，OsmiR444的過表達進一步增強了水稻對條紋葉枯病的抗性，而抗性的上調則是通過上調OsRDR1的表達實現的。通過進一步分析，他們發現在OsmiR444上調后，OsMADS23、Os?MADS27a和OsMADS57作為OsmiR444的靶基因，其對OsRDR1轉錄的抑制作用被降低。這些結果表明，一個OsmiR444及其MADS box 靶點直接控制OsRDR1轉錄從而參與水稻抗條紋葉枯病的調控。

為了研究水稻對條紋葉枯病的反應，Yang 等［25］通過深度測序篩選出了與條紋葉枯病相關的miR?NA 及mRNA，并進一步通過qRT-PCR 分析所選的miRNA 及mRNA 的表達差異發現，針對條紋葉枯病，OsmiR1423-5p和OsmiR1870-5p表達上調，其對應的靶標基因RPM1和EFRmRNA 表達下調，這證明通過上調相應miRNA 的表達，植物會對條紋葉枯病產生相應的抵御反應。相似地，Yao 等［26］前期試驗發現OsmiR528通過調控其靶標基因L Ascorbate Oxidase（AO）的表達，植物表現出對條紋葉枯病抗性降低，說明OsmiR528在植物應對條紋葉枯病中起負調控作用，而后期他們發現，OsmiR528-AO這一防御模塊是由轉錄因子SPL9 所調控，通過特異性結合OsmiR528啟動子區域，SPL9 可以正向調控Os?miR528的表達，進一步降低AOmRNA 的水平，從而導致水稻對條紋葉枯病的抗性降低。

3 miRNA 對水稻非生物脅迫的調控

非生物脅迫特別是干旱、鹽堿等是限制植物生長、發育和農業生產力的因素。因此，如何在外界環境不利于水稻生長的情況下，通過水稻體內的調控網絡積極應對非生物脅迫，進而降低外界環境對水稻生長的不利影響，這成為了科學家需要攻克的難點。

3.1 miRNA 對水稻應對干旱的調控

在水稻生產中，由于降雨不足造成的干旱往往會限制水稻的產量。Zhang 等［27］通過對水稻中miR?NA 敲除株系的大規模篩選，鑒定出OsmiR166敲除株系（STTM166）的植物表現出卷葉表型，而該表型通常是水稻受到干旱脅迫時所表現的。STTM166水稻植株的葉片具有較小的球狀細胞和異常的厚壁細胞，并且STTM166 植株氣孔導度降低，蒸騰速率降低，這些變化可以有效地減少植株體內水分的蒸發。敲除OsmiR166后，水稻發生了形態變化，從而一定程度獲得抗旱性。Xia 等［28］通過研究發現，作為水稻生長素受體OsTIR1和OsAFB2可以被OsmiR393靶向調節。過表達OsmiR393后，水稻植株的抗旱性降低。Fang 等［29］在研究中發現，OsmiR164靶向的NAC基因是水稻抗旱性的負調控因子，在水稻中有6 個OsmiR164靶向的NAC基因（OMTN1至OMTN6），OMTN2、OMTN3、OMTN4、OMTN6過表達對生殖期抗旱性有負向影響。Tian 等［30］則證明了OsmiR162b通過調節其靶標基因OsTRE1的表達增加了水稻的抗旱性。

3.2 miRNA 對水稻應對冷脅迫的調控

環境條件對植物的生長發育有重要影響。除了干旱條件之外，冷脅迫同樣是阻礙作物生長和導致減產的環境脅迫之一。

Xu 等［31］在對水稻的低溫脅迫中通過用富氫水預處理，模擬冷脅迫時內源H2產生的生理誘導，而H2的耐冷能力與miRNA（包括OsmiR398和OsmiR319）及其靶基因（包括CSD1、CSD2、PCF5和PCF8）表達水平的變化有部分關系。Tang等［32］發現，水稻中轉錄因子調控許多與植物耐低溫相關的應激反應相關。OsmiR528通過靶向OsMYB30 的正調節蛋白基因（Os06g06050）的F-box區域，降低了轉錄因子OsMYB30的表達。在OsmiR528轉基因水稻中，OsMYB30 表達降低導致 OsBMY2、OsBMY6 和 OsBMY10 表達增加，提示OsmiR528通過調節應激反應相關轉錄因子的表達來提高低溫耐受性。

3.3 miRNA 對水稻應對鎘污染的調控

有毒重金屬由于其不可降解的性質，可以在植物中積累，最終影響人體健康。作為一種非必需的的重金屬，鎘污染是造成食物鏈污染的最重要因素之一，且鎘對植物有著很高的毒性。

為了研究miRNA 在鎘脅迫下的響應功能，Ding等［33］使用微陣列分析了miRNA 在鎘脅迫水稻中的表達情況。在對miRNA 在水稻中鎘調控的研究中，Ding 等［34］發現在鎘脅迫下，水稻中OsmiR192過表達抑制了種子萌發和幼苗生長。OsmiR390的表達水平在鎘脅迫下顯著下調。因此作為OsmiR390的靶基因，OsSRK在鎘脅迫下表達水平上升。與野生型水稻相比，過表達OsmiR390的轉基因水稻對鎘的耐受性降低，積累的鎘量增加。與此同時，OsSRK在過表達OsmiR390植物中的表達較野生型少。這些結果證明，OsmiR390是水稻抗鎘脅迫的負調控因子［35］。2017 年，Ding 等［36］又通過研究發現了Os?miR268在水稻鎘脅迫中的作用。在鎘脅迫下，水稻中OsmiR268的表達明顯受到影響。鎘處理下的植株中OsmiR268靶基因NRAMP3的表達顯著降低。OsmiR268的過表達則使水稻幼苗在鎘脅迫下的生長被抑制。過表達OsmiR268的植株葉片中過氧化氫和丙二醛含量增加，幼苗累積的鎘含量增加。這些結果表明，OsmiR268是水稻抗鎘的負調控因子。2018 年，Ding 等［37］通過研究發現OsmiR166在水稻鎘積累及抗性中的作用。OsmiR166靶向編碼Ⅲ類同源結構域-亮氨酸拉鏈（HD-Zip）家族蛋白的基因，過表達OsmiR166增強了水稻對鎘的抗性。在鎘處理條件下，編碼HD-Zip 蛋白的OsHB4基因出現上調，而在過表達OsmiR166的轉基因水稻植株中該基因則出現下調。過表達OsHB4使得轉基因水稻葉片和子粒對鎘的敏感性增強以及鎘積累增加。

3.4 miRNA 對水稻應對砷污染的調控

作為廣泛存在于自然界的環境類金屬，砷對生物有極高的毒性。在水稻中，已有數十種miRNA 被證實對砷脅迫具有響應性。Liu 等［38］發現，過表達OsmiR528（Ubi：：OsmiR528）的轉基因植株對砷的敏感度高于野生型（WT）水稻。在砷脅迫條件下，Os?miR528-5p和OsmiR528-3p的表達量在植物的根和葉中均顯著上調。與野生型植株相比，Ubi：：Os?miR528植株在砷暴露后產生過度的氧化應激反應和顯著的根、葉氨基酸含量變化。在砷脅迫的條件下，水稻中OsmiR172c會下調表達，從而引起AP2的上升表達，而AP2作為一個與花發育相關的基因，其上升表達會引起水稻從營養生長向生殖生長轉變［39］。

3.5 miRNA 對水稻應對鹽脅迫的調控

植物會受到鹽的特異性影響，細胞內Na+或Cl-濃度過高會導致毒性。面對鹽脅迫時，通過調控其靶基因，miRNA 可以介導水稻的鹽脅迫反應。

OsmiR319是植物中最早被鑒定和保存的mi?croRNA 家族之一，OsmiR319的表達受環境刺激的調控，提示其參與植物應激反應，Zhou 等［40］發現，過表達OsmiR319a的轉基因植株會表現出形態變化，同時表現出更強的耐鹽性。基因表達分析表明，在過表達OsmiR319a時，至少有 4 個OsmiR319靶基因，即AsPCF5、AsPCF6、AsPCF8 和AsTCP14，以及水稻NAC 域基因AsNAC60的同源基因下調。結果證明OsmiR319控制了植物對干旱和鹽堿脅迫的反應。水稻的非生物抗逆性增強與OsmiR319靶基因的顯著下調有關。Yang 等［41］通過研究發現，由 T-DNA插入引起的水稻dh 突變體OsmiR171c過表達顯著降低了水稻的耐鹽性。與野生型（WT）相比，dh 突變型降低游離脯氨酸含量，提高了鹽處理后的失水率，葉片表皮氣孔密度也增加。在鹽脅迫下，dh突變體的幾個應激反應基因較野生型明顯下調。這些結果表明，OsmiR171c有助于水稻耐鹽。除此之外，Xia等［28］發現，過表達OsmiR393的水稻植株耐鹽性降低。

作為2 種對鹽度有反應的基因，AsAAO和COP?PER ION BINDING PROTEIN1的 表 達 量 在Os?miR528過表達植株中顯著下調，OsmiR528過表達水稻提高了植物對鹽的耐受性。Yuan 等［42］試驗證明，OsmiR528在調節植物對鹽分響應方面發揮關鍵作用，并表明了操縱OsmiR528可以提高植物非生物抗逆性的潛力。

在OsmiR396對水稻鹽脅迫調控的研究中發現，過表達OsmiR396c的水稻植株對鹽脅迫耐受性降低。在相同的處理條件下，過表達OsmiR396a/b的轉基因植株對鹽的耐受性呈上升趨勢，這暗示miR?NA 同一家族不同成員在脅迫抗性中可能發揮不同作用［43］。

4 miRNA 對水稻產量的影響

大量的研究結果證明，miRNA 對水稻產量具有十分重要的影響。在水稻中，由于miRNA 對靶基因有負調控作用，因此在水稻的調控網絡中占據十分重要的地位。

2010 年，Jiao 等［44］發現，IPA1 數量性狀位點編碼OsSPL14、OsSPL14在體內則是由OsmiR156調控表達。OsmiR156能夠通過切割編碼OsSPL14的mRNA 負調控其表達。通過研究，他們發現在對Os?SPL14進行點突變后，干擾了OsmiR156對OsSPL14的調控，從而產生一個理想的水稻植株。該植株增加了水稻的抗倒伏性，提高了水稻產量。隨后Wang等［45］發現，OsmiR156不僅調控OsSPL14，同時會調控OsSPL16，過表達OsmiR156會抑制OsSPL16的表達，導致種子出現細長的表型，從而影響水稻子粒大小，并進一步影響產量。Si 等［46］發現OsmiR156也會調控OsSPL13，而OsSPL13是由一個主要的數量性狀位點GLW7 編碼，并且正向調節細胞大小，從而提高水稻的谷粒長度，并進一步增加水稻產量。在對OsmiR172的研究進程中，早在 2009 年，Zhu 等［47］就發現過量表達OsmiR172可以延緩水稻的小穗分生組織向小花分生組織轉變，這一轉變會導致水稻花和種子發育缺陷，產生的這些缺陷會進一步導致水稻產量降低。2014 年，Lee 等［48］發現OsmiR172的過表達會顯著縮短開花時間，這意味著OsmiR172具有誘導作用。而研究進一步證明OsmiR172的水平隨著植物的衰老而增加。

除此之外，OsmiR396、OsmiR397及OsmiR398均會對水稻產量產生影響。2015 年，Che 等［49］、Duan等［50］、Gao 等［51］都證明OsmiR396調控 GRF 家族的不同成員從而影響水稻產量。OsmiR397是水稻內源性miRNA，作為一個在幼穗和子粒中高表達的基因，當過表達OsmiR397時，水稻的子粒大小會增加，同時促進穗分枝，最終使水稻產量增加25%，這一結果是通過OsmiR397下調其靶點OsLAC所實現的等［52］。在對OsmiR398的研究中，Zhang 等［53］在 2017年通過試驗證明，抑制OsmiR398的表達會導致水稻高度明顯短于野生型，除此之外，穗長變短、種子數量減少，且開花時間與野生型相比短2 周時間。更重要的是，在粒長與粒寬的比較中，抑制OsmiR398表達的植株表現出明顯的減少，進一步導致千粒重降低，進而影響水稻產量。

在水稻分蘗數的研究中，肖之源等［54］發現在過表達OsmiR444.b.2 之后，水稻分蘗增加。利用STTM技術，35 個水稻miRNA 家族的表達水平被降低后，Zhang 等［53］發現 miRNA 參與調控水稻分蘗數。封潔瓊等［55］發現，OsmiR156過表達會導致水稻植株出現矮化，并且分蘗增多。而吳美婷［56］研究表明，突變OsmiR390會導致水稻分蘗數增多，同時種子變長。韋懿等［57］則發現超量表達OsmiR167a后，植株表現分蘗數減少。

5 展望

作為最大的基因家族之一，在真核生物中，miRNA占整個基因組的1%左右。盡管近年來許多研究揭示了miRNA 在調控植物生長發育以及環境適應性方面發揮廣泛且關鍵的作用，但依舊有許多miRNA的作用機制尚不清晰［58］。通過綜合利用轉基因技術、生物信息學技術及高通量測序等技術，可以對miRNA 在水稻中的調控網絡中具體發揮的作用進行深層次的分析及驗證。隨著miRNA 的研究不斷深入，提高水稻產量及水稻抗逆性的調控網絡也會被進一步完善，并為水稻遺傳育種提供新的思路。