棗主栽品種酸組分含量動態變化與相關基因表達分析

童盼盼，張亞若 ，梁豐志 ，吳翠云 ，2，王江波 ，2

（1.塔里木大學植物科學學院/南疆特色果樹高效優質栽培與深加工技術國家地方聯合工程實驗室，新疆阿拉爾 843300；2.新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

棗（Ziziphus jujubaMill）是鼠李科（Rhamnaceae）棗屬（Ziziphus）植物，是中國重要的干果樹種，因其抗旱耐脊且棗果速豐、營養豐富尤其是維生素含量高、入藥還可潤心肺、益氣養容等優點，在促進農民經濟發展和改善生態環境方面居于十分重要的地位［1］。據近幾年的數據統計顯示，全國棗果年產量占世界99%以上，干果產量排名第一［2］。棗作為南疆重要的經濟作物，是農民脫貧致富的途徑之一，但隨著近年來新疆棗產業過剩，提質增效迫在眉睫。棗品質的好壞與棗的糖酸比息息相關，糖酸比是果實中總糖與總酸的比值，可以影響果實的口味、品質以及保質期，同時也是決定棗果實商品價值優劣的重要指標［3］。因此，棗糖酸代謝機制始終是研究者們關注的熱點。

有機酸是果實品質的重要組成部分，果實類型不同有機酸組成及其變化也不同，通常以蘋果酸［4］、檸檬酸［5］為主，趙愛玲等［6］研究發現棗果實中有機酸主要是蘋果酸、奎寧酸和琥珀酸，其中蘋果酸含量最高，屬蘋果酸優勢型，而總酸及各組分酸的含量在不同品種間存在極顯著差異。張春梅［7］基于全基因組重測序，找到了4 個酸代謝關鍵基因并發現棗果實有機酸主要為蘋果酸，而酸棗果實主要為蘋果酸和檸檬酸。陳昕［8］通過研究蛋白質表達模式發現ZjATP-CS1、ZjACO1 和 ZjACO2 是造成酸棗中檸檬酸積累的關鍵蛋白質，ZjMDH3、ZjMS 和ZjNADPME3 是造成酸棗中蘋果酸積累的關鍵蛋白質。馬倩倩［9］研究發現在棗果實發育過程中，ZjCS 相對表達量的變化趨勢與檸檬酸含量的變化趨勢基本一致，檸檬酸的積累主要受ZjCS 的正調控作用，在酸棗果實中，蘋果酸的積累主要受NAD-MDH 酶催化，又受到ZjMdh 的正調控作用。前人已經初步闡明了棗和酸棗果實糖酸風味差異的分子機制。但目前對影響棗主栽品種果實發育時期酸組分含量變化及相關基因差異研究尚無報道，還需深入系統研究。

為了填補這方面的空缺，明確棗主栽品種果實發育時期主要酸組分含量變化與相關基因差異，本試驗以冬棗、灰棗和駿棗3 個棗主栽品種為試材，通過液相色譜儀分析各個品種不同時期主要酸含量組分變化，明確棗主栽品種果實在不同發育時期主要酸組分含量的積累模式，并對棗果實進行RNA 提取、cDNA 反轉錄、qPCR 基因表達模式分析，進而作出棗主栽品種主要酸含量動態變化與相關基因的關聯分析，旨在為今后棗樹的分子育種和遺傳改良奠定基礎，并加快棗分子育種進程。

1 材料與方法

1.1 材料

以新疆主栽的3 個棗品種為試驗材料，分別為以鮮食為主的冬棗、鮮食制干兼用的灰棗和駿棗，材料采摘于塔里木大學園藝試驗站棗種質資源圃，該資源圃地處北緯40°32′，東經81°17′，平均海拔1 100 m，晝夜溫差大，降水稀少，光照時間長，土壤為輕鹽化土［10］。其樹體生長結果良好，樹勢較為均一，無大小年現象，灌溉條件較好，管理水平較高。

于8 月初對栽培條件、管理水平及樹齡大小一致的3 個主栽品種每隔10 d 進行1 次取樣，3 次重復。每份樣品從東南西北各個方向隨機采集30 個棗果，放入冰盒帶回實驗室，及時將棗果果肉分離，并將其隨機分成3 份用液氮速凍后放入超低溫冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 酸組分含量的測定（高效液相色譜法）

1）液相色譜條件。色譜柱為Inertsil AQ（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；二極管陣列檢測器；波長210 nm；根據樣品量自行調控時長；流速0.8 mL/min；流動相為0.04 mol/L KH2PO4緩沖液，用磷酸溶液將其 pH 調配至 2.6~2.8。

2）標準品制備。分別精密稱取蘋果酸、檸檬酸、奎寧酸標準品，用去離子水將其配制為10 mg/mL 標準溶液，分別精密吸取適量上述對照品標準溶液，加去離子水制成蘋果酸、檸檬酸、奎寧酸均為1 mg/mL的混合對照品標準溶液，待測。

3）提取液制備。參照馬倩倩等［11］方法，精密稱取 1 g 果肉，加入 5 mL 0.04 mol/L KH2PO4（pH 2.6~2.8），研磨成勻漿，冰浴超聲提取 20 min 后，轉至4 ℃離心機4 000 r/min 離心10 min，取上清液，殘渣重復加入磷酸緩沖液進行提取，最后定容至10 mL 容量瓶，過 0.22 μm 微孔濾膜待測。

4）含量測定。通過美國Agilent 公司生產的高效液相色譜儀1260 進行測定，根據酸組分回歸方程對棗果實中酸組分進行定量。

1.2.2 棗果相關基因表達檢測

1）RNA 提取。用生工生物工程（上海）股份有限公司生產的B518661 柱式植物總RNA 抽提純化試劑盒進行提取，根據說明書上的方法進行操作。

2）RNA檢測。①取2 μL RNA，用NanoDrop 2000檢測并記錄濃度和質量，濃度最好>300 ng/μL，A260/A280值在1.8~2.1，說明RNA 質量較好，大于2.1 或小于1.8 為純化不合格的樣品，需要重新純化。②1 倍TAE 中1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統檢測，完整的未降解的RNA 電泳圖譜可清晰看到18S rRNA、28S rRNA、5S rRNA 的 3 條帶，且 28S rRNA 的亮度應為 18S rRNA 的 2 倍。

3）cDNA 第一條鏈的合成。用南京諾唯贊生物科技有限公司生產的Z005163HiScriptⅢ1st Strandc DNASynthesisKit 試劑盒進行合成，根據說明書上的方法進行操作。

4）熒光定量PCR 檢測。參考張春梅［7］研究結果以UBQ基因作為qPCR 內參基因，用北京全式金生物技術有限公司生產的AQ141-02 Trana Start Tip Greenq PCRSuperMix 試劑盒對棗酸代謝相關基因的相對表達量進行比較（引物序列見表1）。根據試驗設計的樣本數和重復點樣次數將藥劑加入酶標板中，用封膜密封后放入美國生產的ABIQ5 熒光定量qPCR 儀中，按以下條件進行。HoldStage：1.6 ℃/s 升溫至 94 ℃保 持 30 s；PCRStage：94 ℃保持 5 s，以1.6 ℃/s 速度降至 60 ℃并保持 30 s，循環 42 次；Melt CurveStage：以 1.6 ℃/s 速度升至 95 ℃保持 15 s，以1.6 ℃/s 速度降至 60 ℃保持 1 min，以 0.075 ℃/s 上升至95 ℃保持15 s。默認條件下讀取CT值，試驗結果依據Livak 等［12］的方法，每個基因均以第一發育階段的表達量為參比，計算2-ΔΔCT值進行相對表達量分析，每個發育期樣品基因表達量為3 個生物學重復的平均值。

表1 qPCR 引物序列

1.3 數據統計與分析

使用Excel 2010 軟件對調查數據進行統計分析并作圖，DPS方差分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的建立

將有機酸混合對照品標準溶液逐級稀釋配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 等不同濃度的混合標準溶液，用0.22 μm水系微濾膜過濾，依次進樣10 μL，上機測定峰面積，以有機酸濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，建立線性回歸方程（表2），相關系數為0.996 95~0.999 69。

表2 酸組分測定的線性回歸方程和相關系數

2.2 棗主栽品種不同時期酸組分含量變化與相關基因表達分析

2.2.1 冬棗不同時期酸組分含量變化與相關基因表達分析 由圖1 可知，在冬棗果實發育過程中，3 種酸組分含量變化呈先增加后降低的趨勢，其中檸檬酸在8 月13 日至9 月2 日一直占主導地位，與蘋果酸、奎寧酸變化趨勢一致，緩慢積累。當果實進入脆熟期（9 月12 日），3 種酸組分含量積累速度迅速增加，基本達到發育最高值，此時蘋果酸積累超過檸檬酸，含量達到2.86 mg/g，之后隨著果實逐漸成熟蘋果酸含量迅速下降，而檸檬酸和奎寧酸含量下降幅度較小。

對冬棗果實不同發育時期的相關基因進行qP?CR 分析發現，在從膨大期到白熟期（8 月13 日至9月 2 日）ZjACO2、ZjMDH1和ZjMDH12基因表達量呈現先下降后上升趨勢，而ZjACO1基因表達量呈逐漸下降趨勢，與3 種酸組分含量變化趨勢均相反。冬棗在脆熟期到完熟期（9 月12 日至10 月2 日）的發育過程中，ZjCS2、ZjMDH3和ZjMDH12基因表達量在 9月12 日達到最高，之后呈現下降趨勢，其變化趨勢與酸組分含量變化趨勢一致，而ZjACO1、ZjACO2和ZjCS3基因表達量呈先上升后下降趨勢且均在9 月22 日表達量達到最高。

2.2.2 灰棗果實不同時期酸組分含量變化與相關基因表達分析 由圖2 可知，在白熟期（9 月2—12 日）灰棗果實3 個酸組分含量逐漸積累，當果實結束白熟期后，3 種酸組分含量迅速積累至脆熟期，并均在9 月12 日達到最高，其中蘋果酸含量最高，達到2.985 mg/g。伴隨著果實的進一步成熟（9 月12 至9月22 日），3 種酸組分含量均逐漸下降，但在完熟期（9 月22 至 10 月 2 日）檸檬酸和奎寧酸含量又小幅回升。

對灰棗果實不同發育時期的酸代謝相關基因進行qPCR 分析，發現ZjACO1和ZjCS3基因在果實膨大期（8 月13 日）表達量最低，而在果實完熟期（10 月2 日）表達量最高，而ZjCS2基因在灰棗果實發育過程中表達量呈逐漸下降趨勢，與酸組分含量變化趨勢相反?；覘椩诖嗍炱诘陌l育過程中，所有基因表達量變化趨勢同3 個酸組分含量變化趨勢一致呈現迅速下降，當果實達到完熟期，ZjMDH3和ZjMDH12基因表達量依舊保持下降，與蘋果酸含量變化趨勢一致，而其余基因表達量均處于上升趨勢，這與檸檬酸和奎寧酸含量變化趨勢完全一致。

2.2.3 駿棗果實不同時期酸組分含量變化與相關基因表達分析 由圖3 可知，駿棗果實在發育過程中，3 種酸組分含量均呈先上升后下降再上升的趨勢。駿棗果實發育前期均以積累檸檬酸為主，在進入脆熟期前（9 月2—12 日），蘋果酸迅速積累，超過檸檬酸占據主導地位。當果實進入完熟期（10 月2 日），3種酸組分含量略有回升。

對駿棗果實不同發育時期的酸代謝相關基因進行qPCR 分析，發現ZjMDH12基因在駿棗果實發育過程中呈現逐漸增加后迅速下降的表達趨勢，且所有基因均在果實處于脆熟期（9 月12—22 日）表達量迅速下降，與3 種酸組分變化趨勢相同。除ZjCS2基因外，其余所有基因表達量同3 種酸組分含量均在9月 12 日達到最高，且ZjACO1、ZjACO2和ZjCS3基因表達量與3 種酸組分含量變化趨勢保持一致。

2.3 棗主栽品種果實酸組分含量變化與相關基因表達量的相關性分析

從表3 可知，冬棗、灰棗和駿棗果實內3 種酸組分含量均與ZjACO1和ZjCS3基因表達量呈極顯著正相關，與ZjMDH1和ZjMDH3基因表達量呈正相關，與ZjCS2和ZjMDH12基因表達量表現出負相關關系；ZjACO2基因表達量與奎寧酸含量呈顯著正相關，與蘋果酸和檸檬酸含量表現出正相關關系。

表3 冬棗、灰棗和駿棗果實酸組分含量變化與相關基因表達量的相關性

3 討論與結論

3.1 討論

不同樹種果實的主要有機酸種類和含量存在較大差異，在果實發育過程中有機酸含量大多呈先升高后降低的趨勢［13］。試驗結果表明，3 個棗主栽品種完熟期均以蘋果酸含量最高，根據鄭麗靜等［14］對不同水果有機酸的劃分，棗屬于蘋果酸優勢型，是引起3 個棗主栽品種果實酸味的主要成分。本試驗發現，3 個主栽品種酸組分含量均在白熟期進入脆熟期迅速增加 且達到最高值。這與張春梅［7］研究發現棗的酸含量在發育過程中呈積累趨勢，且在白熟期或半紅期達到最高的結果相一致。而Nergiz 等［15］研究發現橄欖有機酸含量隨果實的發育呈上升趨勢，在成熟期含量達到最高，與本研究結果有差異，這可能與品種不同等因素影響有關，尚待進一步研究認證。本試驗中，冬棗果實中酸組分含量均隨果實發育而增加隨果實成熟而減少，而灰棗和駿棗果實中檸檬酸和奎寧酸含量伴隨著果實的進一步成熟呈現增長趨勢，這與馬倩倩等［13］測得駿棗蘋果酸質量分數在發育過程中的變化趨勢呈現緩慢積累到迅速積累之后伴隨果實的進一步成熟，蘋果酸質量分數略微下降的變化趨勢基本一致。也與李甲明等［16］測得梨果實中檸檬酸含量在整個發育過程中均呈先上升后下降的趨勢基本一致。

灰棗和駿棗果實中ZjACO1、ZjACO2和ZjCS3基因表達量均在膨大期最低，在進入脆熟期表達量最高，之后迅速下降，在完熟期有所增加，整體呈現“S”曲線，其表達量趨勢與各個酸組分含量變化趨勢相一致，且3 個棗主栽品種果實的3 個酸組分含量與ZjACO1和ZjCS3基因表達量呈極顯著正相關關系。張上隆等［17］認為早期Aco 的低活性對果實早期有機酸積累起作用。Shangguan 等［18］在對蘋果、葡萄及甜橙的Aco 研究認為高的Aco 表達有助于檸檬酸和蘋果酸的合成。張春梅［7］研究發現ZjCS2在棗果實成熟過程中表達較低且穩定，ZjCS3在棗果實成熟中一直呈增加趨勢。因此，ZjACO1、ZjACO2和ZjCS3基因對3 個棗主栽品種的3 個酸組分含量的積累密切相關。本研究發現冬棗、灰棗和駿棗果實中ZjCS2和ZjMDH12基因表達量與其3 個酸組分含量變化趨勢有較大差異，而ZjMDH1和ZjMDH3基因表達量在脆熟期后與其3 個酸組分含量變化有相同趨勢，且3個棗主栽品種果實中3 個酸組分含量與ZjCS2和ZjMDH12基因表達量呈負相關關系，與ZjMDH1和ZjMDH3基因表達量呈正相關關系，這與張春梅［7］研究判斷ZjMDH1和ZjMDH3可能是影響蘋果酸合成的關鍵基因相一致，而與其研究發現ZjMDH12促進棗蘋果酸的代謝結果相反，這可能與研究材料的生長環境等因素有關，有待進一步研究。因此ZjCS2和ZjMDH12基因對3 個棗主栽品種的3 個酸組分含量的降解起到一定的調控作用，而ZjMDH1和ZjM?DH3基因對其酸組分含量的積累也發揮著一定的作用。

3.2 結論

3 個棗主栽品種果實發育前期均以檸檬酸積累為主，從白熟期結束進入脆熟期蘋果酸開始迅速積累并占主導地位。其果實發育過程中蘋果酸、檸檬酸和奎寧酸含量變化趨勢基本一致，均呈現先升高后下降的趨勢，但脆熟期之后冬棗的3 種酸組分含量持續下降，灰棗、駿棗酸含量在完熟期時均略有回升。3 個棗主栽品種果實成熟時蘋果酸含量最高，表明蘋果酸是引起其果實酸味的主要成分。棗果實發育過程中ZjACO1、ZjACO2和ZjCS3基因與蘋果酸、檸檬酸和奎寧酸的積累密切相關，而ZjCS2和ZjMDH12基因對其酸組分的降解起到一定的調控作用。