濕腌時鹽質量濃度對草魚肌肉組織結構和品質的影響

姜晶丹，楊明遠，許長華，施文正，盧 瑛

（上海海洋大學食品學院，農業農村部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306）

草魚是我國主要淡水養殖魚種之一，有較高的營養價值[1]，深受人們歡迎。在我國，草魚產量常年穩居養殖魚類首位，2018年達到534.56萬 t[2]。目前，草魚除鮮活銷售之外，大多是經企業加工后再銷售，但是因企業使用的傳統生產技術存在生產效率低和產品競爭力不足等缺點[3]，使得企業淡水魚產業的加工率低[2]。因此，草魚的加工技術和生產方式亟待改進，以迎合消費者對安全、衛生、健康產品的需求，并實現規模化生產。

腌制是我國水產品加工的傳統方法之一，腌制產品廣受消費者喜愛[4]。食鹽腌制作為最基本的腌制方法主要分為干腌法、濕腌法和混合腌制法，干腌雖然操作簡便，但腌制時間長且易造成腌制產品品質下降，混合腌制法因其生產工藝復雜，運用不多，而濕腌法雖然勞動量相較于干腌法大，但其可縮短腌制時間，且產品肉質柔軟，在水產品腌制加工中廣泛運用[5]。目前國內外關于濕腌魚類的研究大多是關于滲透動力學[6-7]和魚類蛋白質的氧化機制[8-11]，水產品在濕腌過程中魚肉組織內部和鹽溶液間發生一系列運動，除水分和氯化鈉的相互傳質外，還包括蛋白質、脂肪等物質的變化[12]，而在腌制過程中蛋白質、脂肪等的變化對水產品營養品質和質構的影響研究仍較少[13]，因此，研究肌肉組織在濕腌過程中發生的質構或者品質變化及其原因，對于改善濕腌產品品質、開發健康的方便水產品具有重要的意義。本實驗以草魚為原料，探究鹽質量濃度（30、60、90、120 mg/mL）對魚肉肌肉蛋白質、水分、脂肪和肌肉組織結構和質構的影響，以期為營養、高品質方便水產制品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活草魚購于上海市浦東新區蘆潮港，規格為1.5～2 kg/條，致死方式為二氧化碳窒息；食鹽購于農工商超市。

濃硫酸、鹽酸（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；硫酸鉀、硫酸銅、石油醚、β-巰基乙醇（均為分析純） 麥克林生化科技有限公司；R-250考馬斯亮藍染色液、2×上樣緩沖液、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、Tris（均為分析純） 生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白質Marker（10～200 kDa） 上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

DHG-9053A鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；PL2002電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；IKA T10勻漿機 上海楚柏實驗室設備有限公司；Z36HK高速冷凍離心機 德國Hermle公司；TA.XT plus物性測試儀 超技儀器有限公司；FOSS Kjeltec 8400全自動凱氏定氮儀、FOSS Soxtec 2050全自動索氏脂肪浸提儀 上海瑞國際芬貿易有限公司；TS-8脫色搖床 江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；Meso MR23-060H-I低場核磁共振儀 上海紐邁電子科技有限公司；Spotlight 400傅里葉變換紅外光譜儀 珀金埃爾默儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

新鮮草魚，一整條裝袋，袋中裝水，水中充二氧化碳氣體直至活魚死亡，去鱗、頭、骨、內臟，流水洗凈，切塊稱質量，隨機分成5 組，每組5 塊。采用濕腌法進行腌制，鹽質量濃度分別為30、60、90、120 mg/mL，腌制溫度為4 ℃，腌制時間30 min，新鮮魚作為對照（C）。

1.3.2 營養成分測定

針對魚肌肉組織樣品，采用GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法測定粗蛋白，采用GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》中的索氏抽提法測定粗脂肪。

1.3.3 離心損失率測定

根據Jiang Qingqing[14]的方法，稍作修改。將樣品切塊（1 cm×1 cm×0.5 cm），稱質量于離心管中，在離心管底部放入吸水紙，以8 000 r/min離心20 min，稱取離心后樣品的質量。通過下式計算離心損失率：

式中：m0為離心前樣品質量；m1為離心后樣品質量。

1.3.4 硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric reactive substances，TBARS）值測定

參考包建強等[15]的方法，稍作修改。準確稱取攪碎的魚肉5.00 g加入25 mL 20%的三氯乙酸，勻漿后4 ℃靜置1 h，以8 000 r/min離心10 min，過濾后蒸餾水定容至50 mL，取濾液5 mL，加入0.02 mol/L的硫代巴比妥酸溶液5 mL混勻后，沸水浴20 min，冷卻至室溫后在532 nm波長處測吸光度。空白對照以5 mL 20%三氯乙酸代替5 mL濾液。每個樣品3 個平行，結果以mg/100 g表示。

1.3.5 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

參考Shi Yan等[16]的方法，稍作修改。稱取3 g樣品，加入27 mL溶解液（5% SDS，0.1%）勻漿，80 ℃水浴1 h后，8 000 r/min離心20 min，上清液過濾后稀釋至蛋白質量濃度1 mg/mL。將處理好的蛋白質樣品與SDS-PAGE樣品緩沖液1∶1混合，沸水浴5 min。電泳時，采用5%濃縮膠和10%分離膠制成凝膠，樣品量為8 μL。設置電源電壓進行跑膠，待電泳結束后取出，染色1 h，脫色至蛋白質條帶清晰。

1.3.6 質構參數

取草魚背肉切成3 cm×2 cm×1 cm塊狀，使用質構儀TA.XT Plus進行TPA測試，對草魚的硬度、彈性和咀嚼性進行測定。設定參數：探頭型號P50，觸發力5 g，測試速率為1 mm/s，最后結果為6 次平行實驗結果的平均值。

1.3.7 低場核磁共振分析

參考卞瑞姣等[17]的方法，稍作修改。取3 cm×1 cm×1 cm的魚塊，每個樣品取3 個平行。采用MesoMR70核磁共振成像分析儀進行測定，共振頻率23.143 MHz，磁體強度0.54 T，線圈直徑為70 mm，磁體溫度為32 ℃。

T2測試參數：P1=20 μs，P2=36 μs，TW=2 000 ms，TE=0.4 ms，NECH=4 000，NS=4，SW=200 kHz。使用核磁共振分析測量軟件及CPMG序列采集樣品信號, 采用SIRT 1000000進行反演。

1.3.8 微觀結構分析

掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）樣品：將草魚魚片切成3 mm×3 mm×2 mm大小，用2.5%戊二醛4 ℃固定24 h，接著用磷酸緩沖液漂洗樣品，然后用乙醇溶液和甲醛進行梯度沉淀，最后將處理好的樣品進行冷凍干燥，噴金后進行觀察。

透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM）樣品：將用磷酸鹽漂洗的樣品，用乙醇和丙酮溶液梯度洗脫后，再用四氧化鋨固定后進行觀察。

1.3.9 紅外光譜數據采集

原始光譜采集：取5 g魚肉攪碎成魚糜狀，冷凍干燥24 h除去水分，之后將其與溴化鉀碎晶按1∶100混合研磨充分后，用傅里葉紅外光譜儀進行光譜采集，波數范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，光譜累加32 次。

二階導數譜圖：將原始光譜圖用譜圖處理軟件PerkinElmer Spectrum（Version 10.4.3）進行基線校正、13點多項式最小二乘法平滑處理得到樣品的二階導數譜圖。

1.4 數據分析

采用SPSS 20.0、單因素方差分析（ANOVA）對數據進行統計分析，并用Excel制圖。

2 結果與分析

2.1 濕腌對草魚肌肉蛋白質的影響

圖1 不同鹽質量濃度下魚肉粗蛋白含量Fig. 1 Crude protein content of cured grass carp with different salt concentrations

蛋白質是組成魚類肌肉的主要成分，淡水魚肌肉中粗蛋白質量分數一般在15%～22%，而草魚的蛋白質質量分數大致在18%左右[5]。魚類肌肉蛋白質可分為肌原纖維蛋白、肌漿蛋白和肌基質蛋白三大類，而肌原纖維蛋白占肌肉蛋白總量的50%以上[18]。目前有許多研究發現腌制會引起肌肉蛋白質的降解和聚集[19]，導致蛋白質變性。從圖1可以看出，在濕腌過程中，當鹽質量濃度為30 mg/mL時，草魚蛋白質含量沒有發生變化，當鹽質量濃度逐漸增加時，粗蛋白含量逐漸降低，說明草魚蛋白質有流失，此結果與郝子娜等[20]鱸魚腌制加工結果一致。從圖2可以看出，30 mg/mL質量濃度鹽腌制草魚肉中的蛋白質條帶的數量和強度與新鮮草魚的樣品最接近，表明30 mg/mL的鹽質量濃度對草魚肌肉蛋白質影響不大；當鹽質量濃度達到120 mg/mL時，魚肉組織中的肌球蛋白和肌動蛋白條帶變細，且強度變弱，表明蛋白質的含量減少，其可能是蛋白質流失或降解導致的。隨著鹽質量濃度的增加，蛋白質含量明顯下降，可能是鈉離子和帶相反電荷的蛋白質基團相互作用，從而形成了一個離子雙電層，降低了蛋白質分子間的靜電相互作用，導致蛋白質的水化[21]。張蕊[22]研究發現在鹽離子溶液中蛋白形態會發生改變，主要是蛋白二級、三級和形態因子的改變，從而導致蛋白構象的改變，致使蛋白發生變性，變得更易流失。

圖2 不同鹽質量濃度下草魚肌肉的SDS-PAGEFig. 2 SDS-PAGE patterns of proteins from cured grass carp muscle with different salt concentrations

2.2 濕腌對水分的影響

魚肉的持水能力被認為與蛋白質性質和組織微觀結構密切相關，尤其是肌纖維的膨脹[23-24]。如圖3所示，30 mg/mL鹽質量濃度的離心損失率最高，其后隨著鹽質量濃度的增加離心損失率逐漸下降，表明隨著鹽質量濃度增加，草魚肌肉的持水能力是下降的。食鹽會增強水的極化作用，使得蛋白質周圍的雙電層厚度發生變化，從而影響蛋白質的穩定性[18]。在低鹽質量濃度下，蛋白質表面的雙電層厚度增加，蛋白質的持水性加大，當鹽質量濃度加大時，蛋白質表面的雙電層厚度減少，蛋白質的穩定性降低，從而使得蛋白質發生流失。

圖3 不同鹽質量濃度下草魚肌肉離心損失率變化Fig. 3 Centrifugal loss rate of cured grass carp muscle with different salt concentrations

在草魚腌制過程中，由于鹽類會和氨基酸側鏈基團競爭水分子，因此濕腌溶液的鹽離子強度會對存在于蛋白質網絡結構中的不易流動水、自由水以及結合水的狀態產生影響，從而導致魚肉質構發生變化。因此通過低場核磁共振技術對魚肉水分變化進行分析。圖4是低場核磁共振測定的不同質量濃度鹽腌制的草魚T2橫向弛豫時間圖譜。弛豫時間的變化表征不同腌制鹽質量濃度下不同水分的遷移情況，即不同狀態下水分的結合狀態和遷移程度，而峰面積代表著不同狀態水的含量。從圖中可以看出，草魚共產生了3 個峰，分別對應3 種水分相態，即結合水T21（0.01～10 ms）、不易流動水T22（10～100 ms）和自由水T23（＞100 ms）。由圖4可見，30 mg/mL和60 mg/mL質量濃度鹽腌制的草魚，其肌肉組織中不易流動水含量最高。結合峰總面積及相應組分所占總水分的百分比（表1），與新鮮草魚相比，隨著鹽質量濃度增加，草魚的A總總體下降，說明草魚水分含量逐漸下降。同時隨腌制鹽質量濃度的增加，結合水S21和自由水S23比例呈減小的趨勢，而不易流動水S22比例增大，表明腌制處理使得部分結合水與自由水轉化為不易流動水。此結果與卞瑞姣等[17]的研究結果一致。

圖4 不同鹽質量濃度下腌制草魚的T2弛豫圖譜Fig. 4 T2 relaxation spectra of cured grass carp muscle with different salt concentrations

表1 總水分面積及相應組分所占總水分的百分比Table 1 Total water area and percentage of each component

由于低鹽處理后草魚肌肉的粗蛋白和水分變化不明顯，但是高質量濃度鹽處理后的草魚蛋白質和水分發生了明顯變化，因此進一步對比分析30 mg/mL和120 mg/mL鹽質量濃度下的草魚肌肉顯微結構。如圖5所示，未處理草魚肌肉組織呈現清晰的多層重疊結構，且粗絲和細絲有規律地交替排列而成的肌原纖維和肌漿亦清晰可見。經30 mg/mL質量濃度鹽濕腌后的肌肉組織，多層次狀結構變薄、相互連接形成片狀，且觀察不到粗絲和細絲，肌原纖維組織變模糊，肌漿團聚狀的嵌在肌肉中。當魚經120 mg/mL質量濃度鹽進行濕腌后，肌肉組織的多層次狀完全消失，呈現片狀外形，且肌漿裂解、縮小。這可能是肌肉組織細胞在低鹽質量濃度下，滲透壓小，蛋白質的水化能力增強，所以組織細胞吸收水分，導致纖維細胞內粗絲和細絲膨脹，細胞間的間隔變小從而連接形成片狀外觀。但在高鹽質量濃度下，水分子和鹽離子之間的相互作用強烈，因而引起蛋白質脫水，組織細胞徹底被破壞，肌漿裂解而水分發生流失。

圖5 濕腌草魚肌肉的SEM和TEM組織微觀結構Fig. 5 Microstructure of wet-cured grass carp muscle observed by SEM and TEM

2.3 濕腌對脂肪的影響

圖6 不同鹽質量濃度下草魚脂肪含量及TBARS值變化Fig. 6 Changes in fat content and TBARS value of cured grass carp with different salt concentrations

從圖6可以看出，隨著鹽質量濃度的增加，TBARS值逐漸上升。低鹽質量濃度對TBARS值沒有影響，隨著鹽質量濃度的增加，TBARS值呈明顯增加趨勢，表明鹽質量濃度越高，草魚脂肪氧化的速度越快。與之相反，草魚的粗脂肪質量分數隨著鹽質量濃度增加而逐漸下降。腌制過程中脂肪氧化可能是由于自身內源性酶活引起的，也可能是濕腌處理加速了肌肉脂肪的氧化[25]。有研究[26]表明肌肉中TBARS值在0.5～1.0 mg/kg之間不會發生明顯的腐敗，由于腌制時間為30 min，即使是高鹽腌制，草魚的TBARS值只有0.198 mg/100 g，由此可見，短暫的濕腌處理對魚肉風味的影響較小。

紅外光譜是分子振動能級的吸收光譜，任何官能團都有紅外吸收，因此紅外光譜可以反映樣品化學成分的綜合信息[27]。魚肉蛋白質的酰胺I帶、II帶紅外光譜特征峰區域分別為1 612～1 698 cm-1和1 523～1 553 cm-1。二階導數紅外光譜可將原譜中重疊峰進行分離，增強光譜的表觀分辨率，從而提高圖譜的指紋特征性并獲得特定化合物的特征峰[28]。由圖7可以看出，相較于未腌制樣品，1 653、1 631、1 625、1 541、1 534 cm-1峰面積在30 mg/mL時增加，但隨著鹽質量濃度增加，這些峰的波長出現位移，且面積變小。這可能是鹽離子奪取水分子從而使得蛋白質的N—H、C—N鍵暴露出來，而當鹽質量濃度逐漸增加后，部分N—H、C—N鍵可能遭到破壞，從而造成這些吸收峰的強度逐漸減弱或發生位移。濕腌后1 747 cm-1處吸收峰（主要歸屬于脂類物質的C＝O伸縮振動吸收）的減弱，很可能是腌制引起脂肪的氧化從而造成脂肪的減少，此結果和TBARS值的分析結果一致。

圖7 不同質量濃度鹽腌制草魚蛋白二階導數光譜圖Fig. 7 econd derivative FR-IR spectra of salted fish with different salt concentrations

2.4 濕腌對草魚質構變化的影響

質構特性是魚肉最重要的特征之一[29]。一般而言，肌纖維越粗、結構越致密則所需的咀嚼力越大，而彈性和硬度則受肌肉的持水性、微觀結構的破壞程度影響較大。由于食鹽影響整個腌制過程的滲透壓，改變蛋白質與水分子之間的相互作用和肌肉組織結構，本研究發現120 mg/mL質量濃度鹽腌制草魚的硬度、彈性和咀嚼性都最低（表2），表明高質量濃度的鹽對草魚肌肉的品質影響比較大，這和該質量濃度下其蛋白質、脂肪、水分以及肌肉組織微觀結構的變化最大一致。離心損失率結果（圖3）顯示30 mg/mL質量濃度鹽腌制草魚的持水性能比較好，而肌肉組織的微觀結構（圖5）顯示30 mg/mL質量濃度鹽對肌肉組織結構破壞比較小，質構分析也發現30 mg/mL質量濃度鹽腌制草魚的彈性和咀嚼性最高（表2）。由此可見，濕腌過程中，高鹽質量濃度對草魚魚肉質構變化具有較大影響，胡曉飛等[30]的研究也發現高鹽導致肌肉組織狀態變化大，硬度下降，和本實驗結果一致。綜合營養組成分、肌肉組織結構和魚肉的質構數據，發現低鹽腌制對草魚肌肉組織結構的影響比較小，其食用品質和未腌制魚肉最為接近。

表2 不同質量濃度鹽腌制草魚的質構變化Table 2 Changes in texture of salted grass carp with different salt concentrations

3 結 論

草魚在濕腌過程中，鹽質量濃度對草魚蛋白質和質構的影響均較顯著。濕腌處理引起草魚肌肉的蛋白質和脂質的官能團發生變化，使得草魚肌肉結構變松散，蛋白質、水分流失，脂肪發生氧化，魚肉品質下降。30 mg/mL質量濃度鹽濕腌的草魚，其肌肉的蛋白質、水分和脂肪變化很小，腌制后的魚肉彈性和咀嚼性增加，說明低鹽腌制的草魚的營養成分損失少，口感佳，可用于營養方便水產制品的開發。