紅曲菌發酵對低鹽半干鯇魚的提味增鮮作用

吳 康，謝靜暉，王倩倩，齊 明，吳建中,*

（1.暨南大學理工學院，廣東 廣州 510632；2.佛山職業技術學院汽車工程學院，廣東 佛山 528137）

鯇魚別名草魚，飼料來源廣、生長迅速，肉質嫩而不膩，營養豐富，深受消費者的喜愛，是中國淡水養殖的四大家魚之一[1-2]。商品鯇魚通常1～5 kg，肉厚刺少，除以鮮活魚銷售外，還適合加工成咸魚，但傳統咸魚鹽分高、肉質硬，不符合現代消費需求。近年來市場出現的低鹽半干魚的鹽分和水分適中，是傳統咸魚的換代產品，將鯇魚加工成低鹽半干魚具有廣闊的市場前景[3]。但低鹽半干魚由于用鹽量低，干燥時間短，缺少了傳統腌制工藝中的自然接種和自然發酵，其口感接近于新鮮魚，缺失了傳統咸魚的醇厚口感。

通過人工微生物接種可以改善半干魚和咸魚等魚產品的口感與品質。著名的徽菜“臭鱖魚”就是典型的發酵魚；周長艷等[4]在傳統腌制魚上接種乳酸菌，結果表明：發酵魚產品咸度、揮發性鹽基氮以及過氧化值都明顯降低，保留了傳統臘魚的口感與香臘味；高繼慶等[5]利用木糖葡萄球菌發酵海鱸魚，結果表明，魚肉硬度、咀嚼性、膠黏性明顯增加，小分子肽和氨基酸含量明顯上升；明庭紅等[6]利用植物乳桿菌發酵草魚，結果表明：草魚肉中的主要腥味物壬醛和2,4-癸二烯醛等逐漸減少，香味物質D-檸檬烯和1-辛烯-3-醇等明顯升高。本課題組將紅曲菌發酵技術引入低鹽半干魚工藝，制作出的產品色香味俱佳，不僅具有傳統咸魚的“臘香味”，而且滋味明顯比普通半干魚更加鮮美。

鮮味是食品五大基本味覺之一，也是深受人們喜愛的美味之一[7]，目前國內外關于發酵魚的研究大多集中在制備工藝和籠統的風味方面，而關于發酵魚中鮮味物質含量和組成的研究較少報道。鑒于紅曲菌發酵對半干鯇魚具有明顯的提味增鮮作用，為揭示其中原因，分別制備紅曲菌發酵型半干魚及其對照品，分別對樣品進行感官評價，測定其水可溶性氮（water soluble nitrogen，WSN）、三氯乙酸可溶性氮（tricholoracetate acid soluble nitrogen，TCA-SN）、游離氨基酸（free amino acids，FAA）、肌苷酸（guanosine 5′-monophosphate，5′-IMP）和鳥苷酸（inosine 5′-monophosphate，5′-GMP）的含量，計算出滋味活性值（taste activity value，TAV）和味精當量（equivalent umami concentration，EUC），通過分析紅曲菌發酵對半干鯇魚鮮味成分的影響，找出其規律，旨在為進一步優化半干魚滋味打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

仙泉湖牌鮮泉鯇魚購買于華潤萬家超市；GIM3.439紫紅曲菌購于廣東省微生物菌種保藏中心。17 種氨基酸混和標準品 美國Sigma公司；AMP標準品、GMP標準品 上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 天津光復精細化工研究所；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HZQ-X100A恒溫振蕩培養箱、電熱鼓風干燥箱上海一恒科技有限公司；YXQ-手提式壓力蒸汽滅菌鍋上海華線醫用核子儀器有限公司；無菌操作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司。LC-20A高效液相色譜 日本島津公司；L-8900全自動氨基酸分析儀 日本Hitachi公司；熱泵干燥設備為實驗室自制。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程及其制備

紅曲菌種子液：1）斜面培養：取活化后的紅曲菌菌種，接入121 ℃高壓滅菌后的PDA試管斜面，30 ℃培養7～10 d；2）擴大培養：將米粉6 g、大豆蛋白2.5 g、硫酸鎂0.1 g、磷酸二氫鉀0.05 g、蒸餾水100 mL混勻，高壓滅菌后得到紅曲菌擴大培養基，然后吸取5 mL無菌水注入斜面中，振搖15 min，將紅褐色的孢子洗入滅菌后的紅曲菌擴大培養基中，于35 ℃、150 r/min搖床培養5 d，得到深紅色均勻的紅曲菌種子液。

紅曲菌發酵劑：按照米-水比例10∶9在大米中加入蒸餾水，蒸熟后，放置超凈工作臺中冷卻至室溫得大米培養基，取無菌水、紅曲菌種子液、大米培養基按3∶4∶20比例接入大米培養基，并攪拌均勻，30 ℃培養2 d得到深紅色的紅曲米，打漿得紅曲菌發酵劑。

普通半干魚制備：將鯇魚去鱗、頭、尾、鰭和內臟，用水沖洗干凈，并切成3 cm×6 cm的小塊，向其中添加3%的食鹽，4 ℃干腌2 h，然后轉移至熱泵干燥器中，在27 ℃、濕度20%的條件下干燥至魚體水分質量分數為50%左右，真空包裝后即為普通半干魚組成品。

紅曲菌發酵魚制備：將鯇魚去鱗、頭、尾、鰭和內臟，用水沖洗干凈，并切成3 cm×6 cm的小塊，向其中添加3%的食鹽，4 ℃干腌2 h后，采用在容器中滾揉涂布的方式接種紅曲菌發酵劑，接種量為9%，然后在30 ℃發酵18 h，最后轉移至熱泵干燥器中，在27 ℃、濕度20%的條件下干燥至魚體水分質量分數為50%左右，真空包裝后即為紅曲菌發酵組成品。

添加滅活發酵劑半干魚制備：將鯇魚去鱗、頭、尾、鰭和內臟，用水沖洗干凈，并切成3 cm×6 cm的小塊，向其中添加3%的食鹽，4 ℃干腌2 h后，采用在容器中滾揉涂布的的方式添加經高溫滅活的紅曲菌發酵劑，添加量為9%，然后轉移至熱泵干燥器中，在27 ℃、濕度20%的條件下干燥至魚體水分質量分數為50%左右，真空包裝后即為添加滅活發酵劑組成品。

1.3.2 感官評價

將干燥結束后的魚塊蒸煮15 min，每次挑選10 名暨南大學食品系教師及學生，分別對成品進行感官評定，采用評分檢驗法進行打分，感官評價標準依照表1[8]。

表1 感官評定標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of low-salt semi-dried fish

1.3.3 TCA-SN的測定

參考Visessanguan等[9]的方法。取魚肉3 g，加入27 mL 10% TCA溶液，均質2 min后冰浴1 h，10 000 r/min、4 ℃條件下離心5 min并取上清液。通過凱氏定氮法測定TCA-SN含量。

1.3.4 WSN的測定

參照Sun Weizheng[10]的方法。稱取3 g樣品，加入15 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH 6.0，50 mmol/L），研磨2 min，4 ℃放置2 h，冷凍離心（10 000 r/min，15 min），快速過濾后取10 mL上清液進行消化，其他步驟同凱氏定氮法。

1.3.5 FAA的測定

參考劉登勇等[11]的方法，并作適當修改，在50 mL離心管中加入約4 g魚肉樣品和20 mL 50 mg/mL磺基水楊酸，均質2 min。將均質后的混合液4 ℃、10 000 r/min離心15 min。取上清液加純水定容到50 mL，將水相過0.22 μm膜，用氨基酸自動分析儀檢測。樣品采用柱后茚三酮在135 ℃條件下衍生，記錄440 nm和570 nm波長處的吸光度。每種氨基酸的定量通過其與氨基酸標準品的峰面積比較確定。通過比較氨基酸標準物的保留時間和峰面積定量樣品中氨基酸的種類和數量。

1.3.6 5′-IMP、5′-GMP的測定

提取：參考Kong Li等[12]的方法，略有改動。取魚肉5 g加入20 mL 10%的高氯酸溶液，研磨，然后10 000 r/min離心15 min，取上清液，沉淀用10 mL 5%的高氯酸溶液洗滌，離心取上清液，用10 mol /L和1 mol/L的KOH溶液調pH值至6.5，靜置30 min，取上清液加純水定容至50 mL。搖勻，過0.22 μm膜后測定。整個過程在0～4 ℃條件下操作。

色譜條件：高效液相色譜儀色譜柱：SUPELCO DiscoveryR C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.01 mol/L磷酸二氫鉀（pH 5.16）；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL；檢驗波長254 nm；分析時間17 min。

采用外標法定量分析，配制GMP和IMP混標溶液，質量濃度分別為10、20、30、40、50 mg/L。以質量濃度（mg/L）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線。

1.3.7 TAV的計算

TAV是樣品中滋味活性物質含量與其呈味閾值的比值。通過FAA、呈味核苷酸和有機酸含量計算出相應的TAV，找出對魚肉滋味有顯著貢獻的成分。當TAV大于1時，認為該物質對呈味有貢獻，而TAV小于1時認為該物質對呈味沒有貢獻，由此可以確定主要的呈味物質[13]。

1.3.8 EUC的計算

EUC衡量呈現谷氨酸鈉鹽滋味活性的氨基酸類（谷氨酸（Glu），天冬氨酸（Asp））與5′-核苷酸整體對食品鮮味的貢獻[14]。如下式所示：

式中：ai為鮮味氨基酸（Glu或Asp）含量/（g/100 g）；bi為鮮味氨基酸相對于味精（monosodium glutamate，MSG）的相對鮮度系數（Glu為1；Asp為0.077）；aj為呈味核苷酸（5′-IMP、5′-GMP）含量/（g/100 g）；bj為呈味核苷酸相對于IMP的相對鮮度系數（5′-IMP為1；5′-GMP為2.3）；1 218是協同作用常數。

1.3.9 細菌總數測定

參照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[15]。

1.3.10 揮發性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）值測定

根據GB 5009.228—2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》中的微量擴散法測定[16]。

1.4 數據處理

數據采用Excel 2007軟件進行整理，采用SPSS 17.0軟件對實驗數據進行統計分析，結果以表示，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 感官評價分析

表2 3 組半干魚產品的感官評價得分Table 2 Sensory evaluation scores of three groups of semi-dried fish products

將3 種半干魚產品隨機編碼后，按表1隨機進行感官評定，結果如表2所示。紅曲菌發酵組產品的滋味和氣味顯著優于其他2 組（P＜0.05），但普通半干魚和添加滅活發酵劑組產品的氣味沒有顯著性差別。紅曲菌發酵組產品的色澤顯著優于其他2 組（P＜0.05），但其質構與其他2 組沒有顯著性差別。從綜合評分上看，紅曲菌發酵組產品得分最高，普通半干魚組次之，添加滅活發酵劑組最低。這可能是由于發酵過程中蛋白質降解而產生了大量多肽和FAA及其進一步代謝產物，這些物質賦予其獨特鮮味口感和特殊發酵風味[17]。

2.2 TCA-SN、WSN的比較分析

圖13 組半干魚產品中TCA-SN、WSN的含量Fig. 1 Contents of TCA soluble nitrogen and WSN in three groups of semi-dried fish products

由圖1可知，添加滅活發酵劑組產品中的TCA-SN從普通半干魚組的（3.474±0.306）mg/g顯著提高到（4.085±0.015）mg/g（P＜0.05）。另一方面，紅曲菌發酵組TCA-SN含量明顯高于添加滅活發酵劑組產品（P＜0.05），表明產品在發酵過程中出現了大量蛋白質降解現象，小肽類物質含量明顯增加。

WSN與TCA-SN含量呈現同樣規律，紅曲菌發酵組WSN含量最高，其次是添加滅活發酵劑組，最后是普通半干魚組，綜上所述，紅曲菌發酵劑中含有一定量的小肽、FAA等含氮物質；在普通半干魚上接種紅曲菌發酵劑，經過一段時間發酵后，產品中的蛋白質被大量降解，導致小分子肽和FAA的含量明顯增加[18-19]。

2.3 FAA的比較分析

由表3可知，除Arg外，添加滅活發酵劑組中各種FAA含量均顯著高于普通半干魚組，鮮味氨基酸和總游離氨基酸也顯著增加（P＜0.05），表明紅曲菌發酵劑中含有一定量的FAA。另一方面，紅曲菌發酵組與添加滅活發酵劑組產品相比，總游離氨基酸含量從（489.50±7.66）mg/100 g顯著增加到（779.69±10.02）mg/100 g（P＜0.05），除Ser、His、Arg外，其他FAA含量均增加，尤其是Asp、Glu、Met、Val、Ile、Leu、Tyr、Phe，其含量增加超過3 倍，其中Asp和Glu為典型的鮮味氨基酸，賦予發酵魚獨特鮮味[20]，同時，芳香氨基酸（Phe）、支鏈氨基酸（Leu、Ile、Val）和Met是許多重要風味化合物的前體物質[21]。

表3 3 組半干魚產品FAA含量Table 3 Contents of free amino acids in three groups of semi-dried fish products mg/100 g

2.4 呈味核苷酸的比較分析

表4 3 組半干魚產品中核苷酸質量濃度Table 4 Contents of nucleotides in three groups of semi-dried fish products mg/mL

半干魚產品的獨特滋味不僅與游離呈味氨基酸有關，還與呈味核苷酸密切相關，一般認為，GMP和IMP具有突出的鮮味，是食品工業中常用的鮮味劑[22]。由表4可知，添加滅活發酵劑組產品中5′-GMP、5′-IMP含量顯著高于普通半干魚組（P＜0.05），尤其是GMP含量增加了5 倍以上。此外，紅曲菌發酵組與添加滅活發酵劑組魚產品相比，5′-GMP、5′-IMP含量顯著增加（P＜0.05），表明紅曲菌發酵過程能有效促進三磷酸腺苷的降解，有助于提升肉質的鮮味。

2.5 滋味物質的呈味作用和鮮味強度評價

滋味物質的呈味作用不僅取決于呈味物質的濃度，還與呈味物質的閾值有關[23]。由表5可知，與普通半干魚組及添加滅活發酵劑組相比，紅曲菌發酵半干魚中5′-GMP、Glu的TAV值均大于1，導致發酵魚的鮮味更加突出，與Lys、His一起構成了紅曲菌發酵魚的主要滋味貢獻物質，其中His能夠使發酵魚的口感更加醇厚。

表5 3 組半干魚產品中滋味物質的含量 、滋味特征、閾值和TAVTable 5 Thresholds and TAVs of taste compounds in three groups of semi-dried fish products

圖2 半干魚產品的EUCFig. 2 EUCs of three groups of semi-dried fish products

EUC是基于FAA與呈味核苷酸之間協同作用對鮮味進行評價的方法，這種分析方法被廣泛應用于食品鮮味特征的研究[27]。如圖2所示，紅曲菌發酵組產品中EUC值最高，為7.34 g/100 g，其次為添加滅活發酵劑組產品中EUC值為1.51 g/100 g，普通半干魚組EUC值最低，為0.20 g/100 g。紅曲菌發酵半干魚中EUC值是添加滅活發酵劑組的4.38 倍，因此紅曲菌發酵半干魚的鮮味程度的得到極大提高。

2.6 紅曲菌發酵對樣品總菌數的影響

由圖3可知，3 組樣品的總菌數從高到低的順序是：紅曲菌發酵組、普通半干魚組和添加滅活發酵劑組。紅曲菌發酵組顯著高于普通半干魚組（P＜0.05），其中原因是經過發酵后，紅曲菌的數量增加。實驗中還發現添加滅活發酵劑組的總菌數低于普通半干魚的總菌數（P＜0.05），推測紅曲菌發酵劑雖然經過滅活，仍然具有一定抑菌作用[28]，抑制了半干魚中微生物的生長。

圖3 半干魚產品的總菌數Fig. 3 otal bacterial counts of three groups of semi-dried fish products

2.7 紅曲菌發酵對樣品TVB-N值的影響

圖4 半干魚產品的揮發性鹽基氮Fig. 4 TVB-N values of three groups of semi-dried fish products

TVB-N值是評估魚肉制品新鮮度和衛生性的重指標[29]。由圖4可知，雖然在30 ℃發酵了18 h，紅曲菌發酵組TVB-N值僅稍高于普通半干魚組和添加滅活發酵組（P＜0.05），此時紅曲菌發酵組TVB-N值仍遠低于25 mg/100 g的安全標準（GB 1036—2015《動物性水產制品》）[30]。

3 結 論

紅曲菌發酵后的半干魚產品滋味更加鮮美醇厚，色澤紅潤誘人；紅曲菌發酵半干魚樣品中WSN、TCA-SN含量顯著增加；總FAA，特別是Glu和Asp等鮮味氨基酸的含量明顯增加，5′-GMP和5′-IMP等呈鮮核苷酸含量也明顯提高。紅曲菌發酵半干魚樣品中5′-GMP與Glu的TAV均大于1，表明該兩成分對產品鮮味味貢獻程度大。紅曲菌發酵半干魚樣品的EUC達到7.34 g/100 g，是添加滅活發酵劑組魚樣品的4.38 倍，表明紅曲菌發酵后的低鹽半干鯇魚鮮味得到明顯增強。經過紅曲菌適度發酵的半干鯇魚，其TVB-N值能夠控制在安全范圍，但鮮味氨基酸和核苷酸含量顯著增加，滋味更加鮮美。