基于高通量基因測序分析腐乳微生物多樣性

陶 康，吳凌偉，金曉芳，任 凱，于政鮮，劉 通，劉明偉，王水興,*

（1.南昌大學資源環境與化工學院，鄱陽湖環境與資源利用教育部重點實驗室，江西 南昌 330031；2.南昌大學中德聯合研究院，江西 南昌 330047；3.江西永叔府食品有限公司，江西 吉安 331500；4.南昌大學食品學院，江西 南昌 330047）

食品發酵是食品加工中最古老的方法之一，傳統的發酵食品因其豐富而飽滿的口感和風味而備受關注[1]。腐乳是中國傳統發酵食品，口味鮮美，質地柔糯，而且營養豐富，深受人們的喜愛[2-3]，它是以豆腐為原料，在適宜的溫度和濕度下由微生物發酵而成[4]。在發酵過程中，各種微生物共同分泌蛋白酶、肽酶、脂肪酶、糖化酶等。它們可以水解大分子，如把蛋白質、脂肪和糖等大分子變成游離氨基酸、脂肪酸和葡萄糖等小分子，很容易被身體吸收[5]。除營養價值外，還含有抗氧化、抗誘變等多種有益生物活性因子[6-7]。

腐乳發酵分為自然發酵和純種發酵，自然發酵腐乳與純種發酵腐乳的品質存在差異，主要是由于腐乳中微生物的種類及豐度存在差異，造成腐乳中的酶系不同，從而影響腐乳的品質。微生物在腐乳的發酵和保藏過程中起著重要作用[8]。由于腐乳生產是開放式的，而自然環境中的微生物是復雜多樣的，包含有益菌和有害菌，各種微生物會侵染進去造成產品質量的不穩定[9]。自然發酵腐乳在生產過程中全是利用自然環境中的微生物進行發酵，有利于發酵微生物之間的協同作用，釋放一些具有功能性的生物活性分子，使腐乳更柔滑細膩[7]。但是，環境中的致病菌、腐敗菌也可能會污染腐乳，因為它們會產生有害的代謝物，一旦它們形成優勢菌，就會造成食品腐壞，給消費者的健康帶來危害，也會給企業造成巨大的損失，例如腐乳的產氣、漏油、發臭、發黑等問題都與微生物有關。純種發酵腐乳是利用特定的微生物發酵，其工業化生產主要利用毛霉或根霉發酵，少量使用細菌發酵。純種發酵的腐乳品質穩定，但是菌種單一，酶系不夠豐富，口感不夠飽滿。微生物群落組成是決定腐乳風味的重要因素，它們之間存在復雜的生化反應[10]。因此，研究微生物多樣性及其理化性質，了解自然發酵腐乳中的有害微生物及有益微生物，對未來指導純種發酵腐乳的改良意義重大[11]。

由于傳統的分離和培養方法不能完全鑒定腐乳中的微生物，因此提出了一種高通量基因測序的方法。高通量基因測序技術作為新型的科學技術，具有準確性高、測序量大的特點[12-14]。目前，高通量基因測序技術已廣泛應用于農業、醫療、食品等領域[15-16]。

本研究利用高通量基因測序方法對江西永豐地區自然發酵腐乳和純種發酵腐乳的微生物多樣性進行對比討論，并分析可能影響腐乳品質的菌株，旨在為腐乳的工業生產提供有效數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

永叔公純種發酵腐乳（編號A），永叔公自然發酵腐乳（編號B），桂香婆腐乳（編號C），家庭自然發酵腐乳（編號D），腐乳樣品均來自江西永豐。

DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 美國Axygen公司；QuantiFluor?-ST微型熒光計 美國Promega公司。

1.2 儀器與設備

GeneAmp?9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；MISEQ測序儀美國Illumina公司；DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠；5424R型高速臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品取樣

為了實驗的準確性，A、B、C 3 種腐乳分別從不同瓶子各取樣3 次，作為生物學重復，記為A1、A2、A3，B1、B2、B3，C1、C2、C3；為了驗證測序平臺的準確性，D腐乳從同一個瓶子取樣3 次，作為技術重復，記為D1、D2、D3。在進一步使用之前，將12 個樣品放到實驗室并貯存在-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 基因組DNA提取

首先利用天根-磁珠法土壤和糞便基因組DNA提取試劑盒對腐乳樣品的基因組DNA進行提取，之后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和純度。

1.3.3 PCR擴增

對細菌16S rDNA V3-V4區進行擴增[17]，選用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。對真菌ITS1區域進行擴增，選用引物1737F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和2043R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）。PCR參數：95 ℃預變性3 min，27 個循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min

1.3.4 Illumina MiSeq測序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluor?-ST微型熒光計進行檢測定量。根據Illumina MiSeq平臺標準操作規程將純化后的擴增片段構建PE 2*300的文庫。

構建文庫步驟：1）連接“Y”字形接頭；2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段；3）利用PCR擴增進行文庫模板的富集；4）氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段。

利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺進行測序（上海美吉生物醫藥科技有限公司）。原始數據上傳至NCBI數據庫中。

1.3.5 高通量基因測序數據處理

原始測序序列使用Trimmomatic軟件質控，使用FLASH軟件進行拼接：1）設置50 bp的窗口，若窗口內的平均質量值低于20，則從窗口開始截去后端堿基，去除質控后長度低于50 bp的序列；2）barcode需要精確匹配，引物允許2 個堿基的錯配，去除模糊堿基；3）根據重疊堿基overlap將兩端序列進行拼接，overlap需大于10 bp。去除無法拼接的序列。

使用UPARSE軟件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/），根據97%的相似度對序列進行可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類；使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier（http://rdp.cme.msu.edu/）對每條序列進行物種分類注釋，細菌與Silva數據庫（SSU123）進行比對，真菌與數據庫Unite（Release 7.0 http://unite.ut.ee/index）進行比對。設置比對閾值為70%。

通過分組樣品，可以很好地進行物種組成分析、樣品比較分析和樣品差異分析。這種分組分析方法不僅可以獲得每個樣品中微生物的多樣性和豐富度信息，還可以比較不同樣品之間的顯著差異，從而分析具體問題。因此，將12 個樣品分為4 組，分別為A（A1、A2、A3），B（B1、B2、B3），C（C1、C2、C3），D（D1、D2、D3）。

2 結果與分析

2.1 樣品數據統計

通過對細菌16S rDNA基因測序，12 個樣品共獲得538 856 條序列，平均長度約為470 bp。所有序列均按97%相似度歸為OTU，共聚合了281 個OTU。對真菌ITS1區進行測序，從12 個樣品中得到612 182 個序列，平均長度約為260 bp，累計得到467 個OTU。

2.2 腐乳中微生物多樣性分析

2.2.1α多樣性分析

α多樣性是指一個特定的區域或生態系統的多樣性，常用的度量標準包括Sobs指數、Chao指數、Shannon指數、ACE指數、Simpson指數和覆蓋率。Sobs指數是觀測到的OTU數量，Shannon指數和Simpson指數表示樣品的多樣性，ACE指數和Chao指數表示物種的豐富度，通過檢測和測序得到物種的覆蓋率[18]。對于細菌，如表1所示，樣品A和C的Shannon指數較高，而樣品D的Shannon指數較低，且樣品A、C的Shannon指數與樣品D差異較明顯，這與圖1a分組統計的t檢驗結果一致。說明樣品A、C中細菌多樣性好，種類多，在發酵過程中侵染的微生物較多，可能是生產中沒有控制好環境中的微生物或者是季節的影響，樣品A、C在夏天生產，樣品D在冬天生產，而夏季的高溫更適合細菌繁殖。在表2中，對于真菌，樣品A物種多樣性較高，樣品D多樣性低，這與圖1b中兩者Shannon指數呈顯著性差異一致。從圖1可以看出，樣品D平行樣之間誤差較小，說明同一個瓶子中樣品差異不大，測序科學、可靠；而不同瓶子中細菌的多樣性差異不大，真菌的多樣性差異卻很大，表明真菌對發酵的條件和溫度要求更高。同時細菌的Shannon指數普遍高于真菌，說明細菌的多樣性好于真菌，腐乳中侵染細菌更多，證明細菌在腐乳發酵中同樣起著很重要的作用，它們可能會造成腐乳的腐敗，但也可能協同作用產生更豐富的酶系，使腐乳中大分子水解更完全，并且形成風味物質，讓腐乳的口感更加飽滿。所有樣品的覆蓋率均大于99%，說明測序對物種的覆蓋率較大，樣品中未檢測到序列的概率很低，這證明了測序結果的可靠性，可以代表樣品中微生物的真實情況。

表1 細菌α多樣性指數Table 1 Bacterial α diversity index

表2 真菌α多樣性指數Table 2 Fungal α diversity index

圖1 基于t檢驗的細菌（a）和真菌（b）Shannon指數差異Fig. 1 Student’s t-test of differences in Shannon index of bacteria (a) and fungi (b)

2.2.2 4 個樣品中微生物群落的關系

圖2 細菌（a）和真菌（b）群落在門水平上的相對豐度Fig. 2 Relative abundances of bacterial (a) and fungal (b) communities at the phylum level

由圖2a可以看出，在細菌門水平上，以變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）為主[19]。Heatmap圖可以通過板塊顏色的相似性及差異性反映多個樣品在各分類水平上群落組成，這樣能直觀地比較分析不同樣品在同一個分類學水平上的的異同[20-21]。如圖3a所示，在屬水平上，從物種和樣品兩個層面進行聚類，發現同一種樣品間會有差別，不同批次有差別，不同種之間有相同點。發酵過程中樣品A的核心屬包括穩桿菌屬（Empedobacter）、乳球菌屬（Lactococcus）、歐文氏菌屬（Erwinia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、Lelliottia[22]；樣品B的優勢菌屬主要是四聯球菌屬（Tetragenococcus）、Pseudomonas、Erwinia、Lactococcus；樣品C主要菌屬為金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、Pseudomonas、Empedobacter、Erwinia、不動桿菌屬（Acinetobacter）；樣品D以Pseudomonas和魏斯氏菌屬（Weissella）為主。分組后取3 個平行樣品的平均值，得出每個樣品的主要優勢種。從圖4a可以看出，4 種腐乳的微生物組成各不相同，而且優勢菌種也不同。但4 種腐乳中都同時含有草莓假單胞菌（P. fragi），在A、B、C、D組中相對豐度分別為2.30%、20.95%、12.51%、48.75%。Pseudomonas是一種革蘭氏陰性需氧菌[23-24]，它們也是造成食物腐敗的微生物區系的一部分，該屬包括對人類、家畜和栽培植物致病的物種。Pseudomonas的細菌多具有分解蛋白質和脂肪的能力，耐鹽性的特性讓其具有生存優勢。P. fragi在樣品A中相對豐度最低，在其他3 個樣品中相對豐度較高，且在樣品D中相對豐度最高。結果表明，自然發酵腐乳易受此細菌污染。樣品D是家庭自然發酵，樣品B、C是在工廠自然發酵。環境越差，這種細菌的含量越高。在腐敗的肉和魚中也發現了這種細菌[25-26]。但也存在豐度很大的有益微生物，例如腐乳中鑒定出的嗜鹽四鏈球菌（Tetragenococcus halophilus），是一類廣泛存在于醬油、腌魚、豆制品等發酵產品中具有耐鹽、耐高滲透壓特性的乳酸菌，可發酵葡萄糖、果糖、甘露糖等糖類產酸。已有研究證明嗜鹽四聯球菌可以提高發酵產品中有機酸、醛類、酯類、氨基酸等多種風味物質含量的作用[27]。對于食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria），研究表明W. cibaria產酸能力、耐鹽能力、降亞硝酸鹽能力均較為突出，可在食品發酵中用于協同[28]，同時還能保證腐乳的質量安全[29-30]。通過分析腐乳中可能影響腐乳品質的細菌菌株，可為以后腐乳品質的改良提供數據參考。

圖3 細菌（a）和真菌（b）屬水平群落結構Heatmap圖Fig. 3 Heatmap of bacterial (a) and fungi (b) community structures at the genus level

由圖2b可以看出，在真菌門水平上，以子囊菌門（Ascomycota）、unclassified_k__Fungi、擔子菌門（Basidiomycota）、毛霉亞門（Mucoromycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）為主。圖3b中，在屬水平上，樣品A主要包括unclassified_k__Fungi和Millerozyma。樣品B中有德巴利酵母屬（Debaryomyces）、曲霉菌屬（Aspergillus）和青霉菌屬（Penicillium）。樣品C的主要優勢菌屬是Debaryomyces和Aspergillus。樣品D的主要屬為Debaryomyces和毛霉屬（Mucor）。圖4b中，在種水平上可以發現酵母菌占了很大相對豐度，其中樣品A中主要是粉狀米勒酵母菌（Millerozyma farinosa），B、C、D中主要是Debaryomyces prosopidis。結果表明，后發酵結束后，腐乳里的真菌以酵母菌為主，這證明了酵母菌在后發酵中對腐乳風味物質的形成有決定性作用。而腐中鑒定出的卷枝毛霉（Mucor circinelloides）、總狀毛霉（Mucor racemosus）、雅致放射毛霉（Actinomucor elegans）等霉菌是純種發酵腐乳中常用的發酵微生物，可以根據它們各自的微生物特性，選擇合適的用于腐乳的復合發酵，從而達到改良腐乳品質的目的。

圖4 細菌（a）和真菌（b）群落在種水平上的相對豐度Fig. 4 Relative abundance of bacterial (a) and fungal (b) community at the species level

2.2.3 主成分分析（principal component analysis，PCA）

從圖5a可以看出，不同組的樣品集中在不同的區域。樣品A集中在左側，樣品D集中在右側，說明樣品A和樣品D的細菌多樣性差異顯著。在圖5b中，樣品A和樣品D的真菌多樣性變化很大。真菌多樣性在樣品B和樣品C間分布較大。樣品D是在同一瓶腐乳中取樣的，所以兩組之間的差異很小。樣品B和樣品C是自然發酵，環境中的微生物比較復雜，溫度、濕度等參數不固定，導致兩組樣品的微生物種類和豐度差異較大。樣品A完全由毛霉純種發酵，生產環境良好，所以樣品A間差異不大。綜合兩圖可得，環境中的細菌變化不大，而真菌變化較大。

圖5 細菌（a）及真菌（b）群落結構的PCA圖Fig. 5 Principal component analysis of bacterial (a) and fungi (b) communities

3 結 論

通過高通量基因測序技術，對腐乳中微生物的多樣性和豐度進行鑒定，分析了腐乳中可能影響腐乳品質的菌株，為腐乳的安全生產和風味改良提供科學依據。無論是自然發酵的腐乳還是純種發酵的腐乳，酵母菌都是優勢菌種，說明酵母菌在后發酵中起著關鍵作用。一方面，酵母菌對發酵風味物質的形成起著不可或缺的作用；另一方面，酵母菌也可能是腐乳產氣從而造成產品漏油的主要原因之一。Pseudomonas在這4 個樣品中都是存在的，這是一種腐敗微生物，腐乳中含量超標會對人體健康產生一定的影響。發酵環境越開放，腐乳中Pseudomonas含量越高，說明環境中的Pseudomonas適合在這種條件下生存。另外，腐乳在發酵過程中會產生一種叫生物胺的物質，這是因為微生物對游離氨基酸的脫羧作用生成，諸如Bacillus、Clostridium、Lactobacillus和Pseudomonas均能產生脫羧酶[31-32]，而本研究通過高通量基因測序的腐乳中發現大量的Pseudomonas和少量Lactobacillus。而且有報道證明Pseudomonas會導致腹瀉[33-35]，這也反映了腐乳安全檢測標準較低，很多有害微生物都沒有在檢測標準中。

在今后的腐乳生產中，可以根據這些微生物的生存特性對其進行控制，提高腐乳產品的質量和風味。但腐乳中也有些利于發酵的發酵微生物，如W. cibaria、T. halophilus、Lactococcus、M. circinelloides、M. racemosus、A. elegans等。通過鑒定腐乳中微生物組成，可以在生產中針對性地抑制有害微生物，而有益微生物可以加以利用，不但可以提升腐乳的風味，而且保證了食品的安全性。