預處理方式對鳙魚骨蛋白酶解液游離氨基酸和揮發性成分的影響

董 燁，張益奇,2,3,*，姚洪正，何光喜，戴志遠,2,3,*

（1.浙江工商大學海洋食品研究院，浙江 杭州 310035；2.浙江省水產品加工技術研究聯合重點實驗室，浙江 杭州 310035；3.海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，遼寧 大連 116000；4.杭州千島湖發展集團有限公司，浙江 杭州 311701）

鳙魚（Aristichthys nobilis）為我國著名的“四大家魚”之一，其繁殖速度快，產量大。鳙魚頭因其味道鮮美，營養豐富，深受消費者喜愛[1]。由于對鳙魚頭的需求不斷增長，在加工過程中產生了大量的魚鱗、魚骨及魚皮等副產物。其中，魚骨富含蛋白質、不飽和脂肪酸、鈣、磷等營養成分[2]，但由于我國目前對魚骨的開發研究較為落后，其通常被直接丟棄，造成資源浪費及環境污染。因此，豐富魚骨蛋白資源的高值化利用，具有一定的研究意義。

蛋白質酶解技術反應條件溫和，較為安全，近年來被廣泛應用于水產蛋白資源的開發利用[3]。但是魚骨結構堅固，因此直接酶解效率低，所需時間長。研究發現，適度熱處理可以使蛋白質的剛性結構柔性化，從而利于蛋白的提取或酶解，提高酶解效率[4]。Fan Weiwei等[5]采用熱處理技術將虹鱒魚骨于121 ℃處理30 min提取魚骨蛋白進行酶解，發現堿性蛋白酶酶解效率最高，其水解度可達15.03%，水解過程中氣味發生了變化，酶解液中共檢測到18 種游離氨基酸和71 種揮發性成分。Tan Xiaoyi等[6]將鱈魚骨于121 ℃處理90 min，對所得魚骨蛋白進行酶解，發現酶解液具有較好的營養價值。近年來，汽爆處理作為一種綠色高效的物理化學預處理方法，廣泛應用于生物質原料的預處理。其基于短時高溫高壓蒸煮，高壓蒸汽進入原料內部空隙，然后瞬間泄壓，將蒸汽內能轉化為機械能并作用于物料，使物料充分解離[7]。目前，汽爆技術在預處理動物材料方面，尤其是處理堅硬骨質方面的研究，得到越來越廣泛的關注。采用汽爆技術處理動物骨，使其在高溫條件下發生軟化，在飽和水蒸汽作用下，骨質被潤脹，孔隙中充滿蒸汽，當瞬間泄壓時，介質急劇膨脹，水蒸氣進行絕熱膨脹做功，蒸汽內能轉化為機械能作用于骨質層間，骨質解離內部膠原蛋白發生裂解，骨質內營養物質流出，同時酶切位點暴露，提高酶解效率。張天鵬等[8]采用汽爆技術處理雞骨，當壓力2.4 MPa、保壓時間680 s時，可以較好地提取雞骨架中的營養物質。Shen Qingshan等[9]發現采用汽爆技術液化雞胸骨軟骨，可以用于硫酸軟骨素的分離，并取得了較好的效果。涂丹等[10]采用汽爆輔助酶解魚皮制備血管緊張素轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽，經0.6 MPa/0.5 min汽爆處理的魚皮，水解度比未處理組提高了1.8 倍，ACE抑制率比未處理組提高了27.14%。但目前，汽爆預處理魚骨對酶解液游離氨基酸和揮發性成分的影響仍鮮見報道。

本實驗采用胰蛋白酶對經汽爆水提處理和熱處理的2 種魚骨蛋白進行酶解，對所得2 種酶解液中游離氨基酸、揮發性物質及分子質量分布進行分析，旨在為提高魚骨資源利用率及其應用領域提供基礎數據和參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鳙魚魚骨 杭州千島湖發展集團有限公司；氫氧化鈉、胰蛋白酶、甲醛（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；碳酸酐酶（29 kDa）、細胞色素C（12.4 kDa）、抑肽酶（6.5 kDa）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-histidyl-leucine，HHL）（429 Da）美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

QBS 200B汽爆機 正道生物能源公司；MLS-3781L高壓滅菌鍋 日本Panasonic公司；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷涂層萃取頭 美國Supelco公司；7890A氣相色譜儀 美國Agilent公司；Trace GC Ultra氣相色譜-DSQ II質譜聯用儀、Fresco 21冷凍高速離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司；S-433D全自動氨基酸分析儀 德國Sykam公司；e2695高效液相色譜 美國Waters公司；400Y多功能粉碎機永康市鉑歐五金制品有限公司；DGG-9123A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；K-360凱氏定氮儀、K-425快速消解儀 瑞士Büchi公司。

1.3 方法

1.3.1 汽爆處理

新鮮魚骨用0.1 mol/L NaOH溶液浸泡4 h，每2 h換一次溶液，除去雜蛋白，流水沖至中性，瀝干備用。取200 g斬碎至6 cm左右的魚骨置于預熱好的汽爆機內，于0.6 MPa保壓2 min，然后在0.1 s內瞬間泄壓，將樣品噴至接收器中，收集汽爆后的樣品粉碎至40 目左右后，于60 ℃水中攪拌使骨蛋白溶于水中，過濾去除骨殘渣，收集濾液為得到的魚骨蛋白提取溶液，冷凍干燥。

1.3.2 熱處理

將魚骨斬碎至0.5 cm左右的骨塊，按料液比1∶3（g/mL）加入蒸餾水，121 ℃提取70 min，過濾去除骨殘渣，收集濾液冷凍干燥。

1.3.3 酶解液的制備

取魚骨蛋白的凍干粉配制成3 g/100 mL的魚骨蛋白溶液，維持溶液pH值為8，酶解溫度為37 ℃，酶比底1∶50（m/m），加入胰蛋白酶，酶解3 h后，于沸水浴中滅酶10 min，8 000 r/min離心15 min，得到2 種酶解物上清液（汽爆預處理魚骨蛋白酶解液記為SFBPH，熱預處理組魚骨蛋白酶解液記為HFBPH）。

1.3.4 水解度測定

采用甲醛滴定法[11]，按下式計算：

1.3.5 游離氨基酸測定及滋味貢獻評價

游離氨基酸采用氨基酸自動分析儀進行測定，分別統計總游離氨基酸、必需氨基酸和呈味氨基酸的含量。滋味貢獻評價采用呈味強度值（taste activity value，TAV），即某一呈味物質的濃度與其閾值的比值[12]。

1.3.6 揮發性成分分析

固相微萃取條件：將2 mL酶解液置于頂空瓶中，然后將密封小瓶在50 ℃下保溫10 min。并將活化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入進樣瓶頂空部分，60 ℃吸附30 min，取出后插入氣相色譜進樣口，250 ℃解吸3 min。

氣相色譜條件：TR-35 MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣；進樣口溫度250 ℃，不分流進樣；升溫程序：初始溫度35 ℃，保持3 min，以2.5 ℃/min升至70 ℃，再以8 ℃/min升至150 ℃，最后以20 ℃/min的速率上升到230 ℃，保持5 min。

質譜條件：檢測器溫度280 ℃；離子源溫度200 ℃；電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；質量掃描范圍m/z30～500。

1.3.7 分子質量分布

參照Zhang Yiqi等[13]的方法。采用Waters e2695高效液相色譜系統和紫外-可見檢測器，檢測波長220 nm，色譜柱為G2000 SWxl（7.8 mm×300 mm），流動相A為乙腈，流動相B為0.1%三氟乙酸溶液，45% A、55% B等度洗脫，流速0.5 mL/min，進樣量10 μL，時間30 min。分子質量校正曲線所用標準品為：HHL（429 Da）、抑肽酶（6 500 Da）、細胞色素C（12 400 Da）、碳酸酐酶（29 000 Da）。

1.4 數據處理

酶解液中揮發性成分通過NIST 2.0譜庫進行定性分析，且僅當正反匹配度均大于800（最大值為1 000）的鑒定結果予以保留。采用OriginPro 2018繪圖，SPSS 21.0進行數據處理及顯著性檢驗，P＜0.05，差異顯著，實驗重復3 次。

2 結果與分析

2.1 水解度分析

圖1 預處理對魚骨蛋白酶解液水解度的影響Fig. 1 Effects of different pretreatments on the hydrolysis degree of fish bone protein hydrolysates

魚骨汽爆水提處理后所得凍干粉蛋白質得率為11.83%，而熱處理后蛋白質得率為8.57%，這可能是汽爆處理使膠原蛋白鏈展開，在60 ℃水提作用下，促進魚骨蛋白的溶出。采用胰蛋白酶對這2 種凍干粉酶解3 h，如圖1所示，HFBPH的水解度為20.59%，SFBPH的水解度為24.85%，高于HFBPH，這可能是在汽爆作用下，魚骨膠原蛋白的三螺旋結構破壞程度大，蛋白質結構疏展，部分蛋白直接降解為小分子物質，暴露出更多酶切位點，更易于酶切，水解度增大，酶解效率高。后續可對經汽爆處理后的魚骨表面黏液測定其分子質量，驗證魚骨膠原蛋白經汽爆處理后發生了降解。

2.2 酶解液游離氨基酸分析

由表1可知，2 種酶解液中均檢測出20 種游離氨基酸，SFBPH總游離氨基酸質量濃度為28.36 mg/mL，是HFBPH（21.78 mg/mL）的1.3 倍，其中亮氨酸在2 種酶解液中的含量最高，分別占總游離氨基酸的25.07%和18.45%。其次為賴氨酸，分別占總游離氨基酸的15.83%和13.91%，均為苦味氨基酸。游離氨基酸對酶解液的整體風味影響較大，是重要的滋味物質，也是香味的前體物質。每種氨基酸的結構特性不同，產生了其獨特的口味特征，根據氨基酸的呈味特性，分為鮮味、甜味、苦味3 種[14]。SFBPH和HFBPH中呈味氨基酸含量豐富，分別占總游離氨基酸的78.70%和78.60%，其中疏水性氨基酸分別占54.78%和56.06%，游離氨基酸的呈味特性與氨基酸的疏水性大小有關，當疏水性大時主要呈苦味，疏水性小時主要呈甜味。

表1 2 種魚骨蛋白酶解液中游離氨基酸分類及含量Table 1 Composition and contents of free amino acids in two fish bone protein hydrolysates

表2 2 種魚骨蛋白酶解液中呈味游離氨基酸TAVTable 2 Taste activity values of free amino acids in two fish bone protein hydrolysates

TAV大于1時，表示該物質對樣品的呈味有貢獻，值越大其貢獻越大，當TAV小于1時，該物質對樣品的呈味無貢獻[15]。表2對SFBPH和HFBPH的呈味氨基酸TAV進行比較。鮮味氨基酸中，2 種酶解液的谷氨酸TAV均大于1，且在SFBPH中稍高于HFBPH，表明SFBPH鮮味較HFBPH突出。天冬氨酸的TAV均小于1，對酶解液鮮味貢獻較小，谷氨酸對魚骨酶解液鮮味的貢獻大于天冬氨酸。SFBPH和HFBPH中甜味氨基酸分別占總游離氨基酸的10.22%和10.05%，2 種酶解液中甜味氨基酸的TAV均較低，說明甜味在魚骨酶解液的滋味中體現較少。2 種酶解液中纈氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸這3 種苦味氨基酸的TAV均小于1，研究發現苯丙氨酸和酪氨酸等苦味氨基酸，當其含量低于呈味閾值時，可增加其他氨基酸的鮮味和甜味[16]。SFBPH和HFBPH中苦味氨基酸TAV大于1的共有5 種，分別為亮氨酸、賴氨酸、組氨酸、甲硫氨酸和精氨酸。TAV最高的苦味氨基酸分別是賴氨酸和甲硫氨酸。HFBPH中甲硫氨酸TAV高達8.80，SFBPH中甲硫氨酸TAV為5.29。甲硫氨酸這類含硫氨基酸對熟肉香味的形成具有重要貢獻[17]。在SFBPH中精氨酸TAV大于1，精氨酸雖顯苦味，但有增加呈味復雜性和提高鮮度的作用[18]。SFBPH和HFBPH的苦味氨基酸含量較高，在總游離氨基酸中百分比分別為64.88%和64.23%，2 種酶解液的整體風味以苦味為主，如何脫苦改善酶解液風味，是亟待解決的問題。

2.3 固相微萃取-氣相色譜-質譜分析

圖2 2 種魚骨蛋白酶解液中揮發性物質含量和組成Fig. 2 Contents of various classes of volatile substances in two fish bone protein hydrolysates

如圖2所示，實驗測得含量較多的物質是烴類和醛類，SFBPH和HFBPH中烴類和醛類物質之和，分別占總揮發性物質的44.69%和21.2%。在SFBPH中醛類、烴類、酮類和雜環類的相對含量高于HFBPH，而醇類、酸類和酯類的相對含量低于HFBPH，這可能較長的熱處理過程中發生了美拉德反應或氨基酸的熱分解反應。表3列出了2 種酶解液中的各自含有的揮發性化合物，共檢測出77 種。其中SFBPH揮發性化合物數量最多達61 種，而HFBPH為47 種，其中共有成分有31 種。

表3 2 種魚骨蛋白酶解液的揮發性成分組成Table 3 Compositions of volatile components in two fish bone protein hydrolysates

續表3

烴類物質主要是烷烴類和烯烴類。烴類物質閾值相對較高，對酶解液的整體風味作用不大[19]，其主要是源于脂肪酸烷氧自由基的裂解。而當存在支鏈烷烴、芳香烴和烯烴時，可能對酶解液的風味有一定的貢獻[20]。由表3可知，SFBPH中烴類物質主要有十七烷、十八烷和(Z)-3-十七烯，HFBPH中主要有十七烷和十八烷。SFBPH中烴類物質相對含量高于HFBPH，可能與其水解度較高有關。芳香烴可能由芳香族的游離氨基酸氧化產生，酶解液中還檢測到的對二甲苯和萘等芳香烴化合物會導致酶解液異味的產生，可能與魚類生長環境受到污染有關[21-22]。

SFBPH和HFBPH中共檢測出8 種雜環類化合物，主要有呋喃、吡啶和噻唑，其中SFBPH中檢測出的雜環化合物相對含量稍高，而HFBPH中檢測出的雜環化合物種類相對較多。雜環類化合物一般閾值較低，對酶解液整體風味貢獻較大。呋喃類主要是氨基酸的熱分解、脂肪氧化和美拉德反應產生，通常具有很強的肉香味，可以起到一定的增香作用，如2-戊基呋喃具有類似火腿的香味[23]。此外，2 種酶解液中還檢測到少量酸類、酯類和酚類物質。酸類物質的閾值很高，對酶解液的風味影響不大。酚類相對含量低，對酶解液的整體風味影響不大，酯類通常具有果香和清香氣味，與酮類共存時對酶解液的風味有協調和平衡的作用[24]。

醛類是酶解液主要的揮發性物質之一，2 種酶解液中共檢測出17 種醛類物質。其中SFBPH中共檢出16 種醛類化合物，相對含量為15.63%，相對含量較高的有壬醛、(E)-2-壬烯醛、(E)-2-癸烯醛、2,4-二甲基苯甲醛、十二醛。HFBPH中共檢測出11 種，相對含量為4.11%，相對含量較高的有2,5-二甲基苯甲醛和壬醛。SFBPH中醛類的揮發性成分相對含量高于HFBPH。醛類物質主要源于氨基酸的Strecker降解反應或脂肪的氧化，其碳原子個數為6～9的醛具有果香、清香和脂肪香味[25]，閾值較低，具有與其他物質重疊的風味效應，對酶解液的整體風味特征具有貢獻[26]。壬醛具有油脂和甜橙氣息，己醛通常產生一種原生味、鮮香和類醛的特征香味，相對含量較高時，具有青草味-脂肪味，(E)-2-辛烯醛呈脂肪味[27]，(E,Z)-2,6-壬二烯醛是產生魚腥味的主要化合物[28]，苯甲醛具有強烈的堅果香，在SFBPH中相對含量較高。

2 種酶解液中酮類物質和醇類物質相對含量和種類較少。在SFBPH中檢測到4 種酮類，含量稍高的是2,3-辛二酮，其具有強烈的奶油味，是新鮮水產品的重要風味物質[29]。2-壬酮具有水果香和花香。酮類物質閾值一般高于醛類，但其具有特殊的花香、清香和水果香，對酶解液的風味形成具有一定作用。醇類主要來源于氨基酸和糖的還原、脂肪酸酶促氧化和醛類物質等[30]，其中HFBPH中醇類物質相對含量高于SFBPH。醇類物質一般具有獨特的花香、果香、清香和甜味等令人愉悅的風味。2 種酶解液中共檢測到9 種醇類物質，主要是飽和醇類。飽和醇類的閾值較高，對酶解液風味貢獻不大。

2.4 酶解液分子質量分布

進一步測定2 種魚骨蛋白酶解液分子質量分布。以分子質量的對數（lgM）為縱坐標，各標準品保留時間（t）為橫坐標，得到標準曲線lgM=-0.209t＋6.992，決定系數R2為0.991 3，根據回歸方程計算出樣品分子質量在各范圍的分布情況，將主要分子質量分布分為3 個部分：大于1 000、1 000～500 Da和小于500 Da。由表4、圖3可知，SFBPH分子質量更小，小于1 000 Da的小分子占73.78%，其中小于500 Da的占35.59%，HFBPH中分子質量小于500 Da的占29%，說明經汽爆預處理的魚骨蛋白酶解更徹底。

表4 2 種魚骨蛋白酶解液分子質量分布情況Table 4 Relative molecular mass distribution of two fish bone protein hydrolysates

圖3 酶解產物分子質量分布色譜圖Fig. 3 Chromatograms showing the relative molecular mass distribution of two fish bone protein hydrolysates

3 結 論

研究汽爆和熱處理2 種不同預處理方式對魚骨蛋白酶解液游離氨基酸和揮發性成分的影響。結果表明，經胰蛋白酶酶解3 h后，SFBPH的水解度為24.85%，高于HFBPH（20.59%），2 種酶解液中分子質量分布小于1 000 Da的小分子分別占73.78%和66.56%。SFBPH中游離氨基酸總量達到28.36 mg/mL，是HFBPH的1.3 倍，SFBPH中TAV最大的為賴氨酸，HFBPH中TVA最大的為甲硫氨酸。SFBPH和HFBPH中呈苦味氨基酸分別占總氨基酸的64.88%和64.23%，可見2 種酶解液整體滋味以苦味為主，如何脫苦是需要解亟待解決的問題。固相微萃取-氣相色譜-質譜共鑒定出77 種揮發性風味化合物，SFBPH中共檢測出61 種揮發性化合物，HFBPH中檢測出47 種，其中烴類和醛類物質最豐富。SFBPH中酮類、醛類、烴類和雜環類物質相對含量高于HFBPH，而在HFBPH中雜環類種類較多，酸類和酯類物質相對含量高于SFBPH。