超聲輔助濁點萃取-液相色譜-串聯質譜法測定蔬菜中天然VK同系物

李凱龍，陳同強，徐文泱，李 濤，王亮亮，王 芳，孫桂芳

（食品安全監測與預警湖南省重點實驗室，湖南省食品質量監督檢驗研究院，湖南 長沙 410111）

VK主要包括2-甲基-3-植基-1,4-萘醌又名葉綠醌（phylloquinone，PK）、甲基萘醌（menaquinone-n，MK-n）和甲萘醌（menadione，MD）[1-2]，PK和MK是VK的天然形式，而MD是一種用作藥物的化學合成衍生物，但也有文獻報道通過飲食攝入后，腸道細菌可以將PK分解為MD的現象[3]。VK不僅與凝血功能有關，而且與骨代謝有關，還被用于治療惡性腫瘤、支氣管哮喘等疾病，近年研究發現，VK缺乏的共同危險因素還包括膳食攝入量不足、吸收不良綜合征（尤其是膽汁淤積性肝疾病）、抗生素治療和腎功能不全等[4]。食物中最常見的VK是PK，它可由所有植物和綠藻產生，蔬菜的綠色強度一般也與PK含量有關[5]。雖然PK普遍存在于各種食物中，但PK的主要食物來源還是綠葉蔬菜和植物油。MK合成由腸道菌群中的細菌完成，其作用是細菌呼吸運輸鏈中的電子載體[1]，所以MK主要存在于肉類、乳制品和發酵食品，如奶酪中，以四烯甲萘醌（menatetrenone 4，MK-4）、七烯甲萘醌（menatetrenone 7，MK-7）最具代表性[5]。

目前，食品中VK的檢測方法主要有毛細管電泳法[6]、液相色譜-串聯紫外檢測法[5,7-8]或熒光檢測法（需要衍生化步驟）[9-11]、液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法，離子源分為大氣電壓離子源（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）[12-14]和電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）[15-18]，離子模式均為正離子模式。VK分析測定的食物基質主要為果蔬[5,12,14,16-17,19-20]、植物油[21-22]、奶制品和嬰幼兒配方奶粉[13,15,23-25]。因VK不穩定，所以提取VK的前處理需避免影響穩定性的因素，如紫外線、堿性和酸性介質等。對于富含脂質基質的食品如牛奶等，還需增加水解步驟，確保脂質盡可能被皂化[13,25]或酶解消化去除[15]。食品中VK常見的萃取方法是利用正己烷從樣品基質中分離維生素，再通過固相萃取（solid phase extraction，SPE）[5,26-27]、基質固相分散萃取（matrix solid phase dispersion，MSPD）[12]或加速溶劑萃取法[19]對提取物的VK進行純化。樣品處理量大，穩定性受到影響。

近年來出現的樣品處理微型化技術可以實現被測物質在最小環境影響下的高濃縮，研究表明分散液液微萃取（dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）[14]、固相微萃取[28]和濁點萃取（cloud point extraction，CPE）法[29]技術對維生素的預濃縮具有很好的效果，與傳統常規萃取方法中用到有毒表面活性劑和易燃有機試劑相比，CPE法的預濃縮過程廣泛應用非離子表面活性劑，是一種高效的綠色微萃取方法。考慮到CPE在預濃縮步驟中的優越性，本實驗優化蔬菜中天然VK同系物的CPE提取方法，并以超聲輔助提取，通過LC-ESI-MS/MS對蔬菜中的PK和MK-4進行定性、定量分析，旨在為食品中VK的檢測、應用和監管提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8 種蔬菜：卷心萵苣（生菜）、上海青、菊苣、羽衣甘藍、菠菜、水芹菜、白蘿卜（根莖）和胡蘿卜（根莖）均為市購。

PK、MK-4標準品（純度≥98%） 美國Sigma-Aldrich公司；非離子表面活性劑聚乙二醇4-叔辛基苯基醚（Triton X-45）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）和聚乙二醇叔辛基苯基醚（Triton X-114）、1-己基-3-甲基咪唑雙三氟甲磺酰亞胺鹽（[C6MIm]NTf2）、1-甲基-3-辛基雙三氟甲磺酰亞胺鹽（[C8MIm]NTf2）和1-十二烷基-3-甲基咪唑雙三氟甲磺酰亞胺鹽（[C12MIm]NTf2） 德國Merck公司；無水硫酸鎂、氯化鈉（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；甲酸銨、乙酸銨、甲酸、乙醇、乙腈（均為色譜純） 上海安譜實驗科技股份有限公司；實驗用水Milli-Q系統純化水。

1.2 儀器與設備

TSQ Quantis LC-MS/MS聯用儀（配有ESI） 美國Thermo公司；A11均質儀 德國IKA公司；UP200H手持式超聲波處理器 德國Hielscher公司；EBA20/20S離心機 德國Hettich公司；M3-L205C家用微波爐 中國美的集團；Milli-Q超純水器 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標準儲備液和工作溶液的配制

分別精密稱取2 種化合物各10.0 mg，用乙醇溶解并定容至50.00 mL。此標準溶液質量濃度為0.20 mg/mL，貯存于棕色玻璃瓶中，-20 ℃避光保存。作為標準儲備液。精密吸取標準儲備液適量，配制混合標準工作液，用乙醇稀釋并定容，其中PK和MK的質量濃度為1.0 μg/mL，-20 ℃避光保存。用乙醇適當稀釋1.0 μg/mL PK和MK的標準工作液配制不同質量濃度的校準標樣，現配現用。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量5.0 μL；流動相A：0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸銨溶液；流動相B：含0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸銨的甲醇溶液；洗脫程序：0～4.0 min，30%～90% A，70%～10% B；4.0～6.0 min，90% A，10% B；6.0～8.0 min，90%～30% A，10%～70% B；8.0～10 min，30% A，70% B。

1.3.3 質譜條件

ESI；多反應監測；噴霧電壓3.0 kV；離子傳輸管溫度325 ℃；霧化器溫度350 ℃；鞘氣（N2）壓力40 psi；輔助氣（N2）壓力10 arb；碰撞氣（Ar）流速2.5 L/h；循環時間0.5 s；Q1分辨率0.7，Q3分辨率0.7。在正離子監測模式下，分別對碰撞能量和選擇離子等質譜參數進行優化，選取碰撞后所得豐度較高的2 個子離子作為特征離子。

1.3.4 樣品前處理

新鮮蔬菜樣品用蒸餾水洗滌數次并自然風干去除多余的水分。為防止VK的降解，需將樣品保存在4 ℃弱光條件下，樣品在到達實驗室后48 h內進行分析。將所有樣品手動切成長寬約0.5 cm的小塊，使用電動均質器均質化。超聲輔助提取分離蔬菜樣品中的維生素，稱取1.5 g樣品至裝有0.15 g氯化鈉的15 mL玻璃離心管中，加入2 mL乙腈。混勻后用超聲探頭直接進行超聲處理，探頭以52.5%振幅、0.75 s脈沖處理1 min，6 000 r/min離心5 min。取1 mL乙腈上清液，加入5 mL含0.4 mg/mL氯化鈉的10 mmol/L乙酸銨溶液（pH 7），加入50 μL的0.15 g/mL的Triton X-45，手動混勻30 s。將所得溶液置于水浴中，并在家用微波爐中以最大功率900 W加熱20 s，得到渾濁溶液，VK提取到通過樣品溶液分散的凝聚層細小液滴中；然后將試管浸入冰浴中5 min，以促進富表面活性劑相的分離，表面活性劑相沉淀在錐形管底部（液滴體積約15 μL），使用微注射器收集，將回收的液滴置于進樣小瓶中，加入30 μL甲醇進行稀釋，然后將其通過自動進樣器注入LC-MS/MS系統。試樣液經LC-MS/MS分析，根據保留時間和離子對定性，外標峰面積法定量。用乙醇配制50 ng/mL的PK和MK混合標準溶液作為陽性質控樣品，-20 ℃條件下可穩定保存1 個月，預實驗表明白蘿卜中未檢測到PK和MK，因此采用白蘿卜作為空白基質樣品用作陰性質控樣品。采用4因素3水平設計對影響CPE萃取效率的不同變量進行優化，即表面活性劑體積、水相體積、氯化鈉質量濃度和加熱時間（表1）。取超聲輔助提取后的1 mL乙腈提取液用于分析物的富集，并用5～9 mL范圍內的不同水量進行稀釋，表面活性劑添加體積在50～150 μL之間，氯化鈉質量濃度范圍在0.2～0.4 g/L之間，當將表面活性劑-萃取相混合物加熱到相應的濁點溫度以上（25～38 ℃之間，取決于質量濃度）時，會形成云層狀渾濁溶液。使用水浴在10～20 min范圍內研究不同加熱時間的影響。所有處理均應將混合物以3 500 r/min離心3 min，然后在-20 ℃冰箱中冷凍5 min，以促進相的分離。

表1 CPE變量試驗設計因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables studied in one-factor-at-a-time design for CPE

1.3.5 加標回收率實驗

加標樣品制備：稱取1～1.5 g（精確至0.1 mg）均質后的2 種蔬菜樣品（萵苣和蘿卜），一份作為基質本底值測定，一份置于25 mL具塞棕色玻璃比色管中，加入適量混合標準溶液，分別添加40、80 ng/g和120 ng/g 3 個水平進行回收率實驗，每個添加量進行6 次平行實驗，同時做空白實驗，均扣除本底值后計算加標回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。室溫放置1 h，待樣品完全吸收標準溶液后，按上述1.3.4節步驟進行前處理，測定不同樣品加標回收率。

1.3.6 檢出限、定量限和精密度實驗

按照上述樣品提取條件，按照信噪比不小于3計算檢出限（limits of detection，LOD），以信噪比不小于10計算定量限（limits of quantification，LOQ）。根據重復性要求，在同一天和不同日期分別測定10 次PK和MK添加含量為100 ng/g白蘿卜樣品的重復性，測定不同樣品日內與日間的精密度，以RSD計算。

1.4 數據處理

圖譜采集和數據處理采用Thermo Scientific TraceFinder TM和Xcalibur數據系統軟件（美國Thermo公司）軟件。所有實驗數據以平均值表示，采用Excel 2010軟件進行數據分析和繪圖，利用SPSS軟件對數據進行統計分析，2 個處理數據采用t檢驗進行比較，2 個以上處理數據采用兩因素方差分析（Two-way ANOVA）進行比較，P≤0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

通過在流動注射模式下將1.0 μg/mL的2 種VK直接注入離子源中，根據2 種VK的化合物結構，選擇在正離子模式下進行優化。采用一級質譜對目標化合物進行母離子全掃描，分析得到[M＋H]＋離子峰；再采用二級質譜，優化碰撞能量等參數，對目標化合物的子離子進行全掃描，每種VK選擇2 個信號穩定且強度高的m/z為定性離子對，選擇其中信號強度高且受基質干擾小的m/z為定量離子對，優化結果見表2。

表2 VK同系物的分子式和分析條件Table 2 Molecular formulae and mass spectrometric parameters of VK homologues

2.2 色譜條件的優化

使用反相液相色譜，通過注入5.0 μL質量濃度為100.0 ng/mL標準溶液優化色譜分離條件。分析流動相A和流動相B的不同比例混合流動相對目標物的分離結果。色譜分離的最終選擇條件、分析化合物的保留時間以及MS/MS儀器參數如表2所示。化合物的保留時間是通過在同一天范圍內進行10 次連續分析和在不同日期進行10 次連續分析而綜合確定的。

2.3 樣品前處理條件的優化

2.3.1 超聲提取步驟的優化

脂溶性維生素分析的食品樣品的前處理通常涉及皂化過程、固液萃取和液液萃取過程，有時還需要酶促水解過程[30]。但因VK在皂化性條件下不穩定，所以本方法不采用皂化處理，而采用乙腈作為提取劑提取食物中的VK也已有文獻報道[14]，因此本方法采用乙腈進行固液萃取。此外，考慮到光和熱對VK穩定性的影響，選擇在室溫和光線較暗的條件下進行樣品處理。使用生菜（添加0.5 μg/g的PK和MK），首先優化樣品量（1.0～3.0 g）和提取液乙腈（1～3 mL）的用量比，結果表明使用2 mL乙腈萃取1.5 g樣品得到的回收率最高，所以該樣液比被選擇用于進一步的優化實驗；通過在乙腈提取液中添加氯化鈉，可以增加維生素向有機相的轉移，且可促進相分離，因此比較0.1～0.5 g范圍內的不同氯化鈉添加量的效果，結果表明添加0.15 g氯化鈉可獲得最佳結果，而再增加氯化鈉的量會降低方法靈敏度，所以選擇在乙腈提取液中添加0.15 g氯化鈉以提高萃取效率；最后比較使用水浴超聲和超聲探頭直接浸入樣品超聲的提取效果，結果表明使用超聲探頭獲得的回收率約為使用水浴超聲的4 倍，而延長超聲探頭超聲時間并沒有提高提取效率，所以采用超聲探頭輔助萃取方法。

2.3.2 預濃縮過程優化

2.3.2.1 萃取方法的優化

圖1 萃取溶劑對萃取效率的影響Fig. 1 Effects of different extraction solvents on extraction efficiency

比較離子液體-分散液液微萃取法和CPE法對VK的預濃縮。為此，分別用100.0 μL離子液體和非離子表面活性劑、0.5 mL乙腈分散劑和10.0 mL含有100.0 ng/mL分析物的水相分析比較[C6MIm]NTf2、[C8MIm]NTf2、[C12MIm]NTf2、Triton X-114和Triton X-45的預濃縮效果。如圖1所示，3 種不同離子液體的離子液體-分散液液微萃取法的富集倍數都只有非離子表面活性劑CPE法的1/3，且CPE法使用的是非有毒試劑，所以本方法采用CPE法對VK進行預濃縮處理，離子液體-分散液液微萃取法和CPE法的比較。

2.3.2.2 萃取溶劑的優化

選擇Triton X-45、Triton X-114和Triton X-100為CPE的優化萃取劑，在預實驗中使用100.0 μL的0.15 g/mL表面活性劑溶液，并將混合物在恒溫水浴中加熱并保持相應的濁點溫度10 min，當使用Triton X-100時，未獲得可收集的表面活性劑富集相，因此不選擇該萃取劑。如圖1所示，Triton X-45用作CPE的萃取劑時可獲得最高的萃取效率。

2.3.2.3 萃取變量的優化

通過單因素試驗對影響CPE萃取效率的不同變量進行優化，如圖2所示，使用最低表面活性劑和水相體積可獲得最佳結果，使用50 μL的Triton X-45可最大程度地降低稀釋效果，同時在低表面活性劑濃度下，CPE的萃取效率也得到了保障，當測定體積小于50 μL時，由于回收量太低導致收集富集相困難，所以選擇Triton X-45的體積為50 μL；當氯化鈉質量濃度為0.4 g/L時VK萃取效率最高；從實用性和時效性分析，用微波爐代替水浴加熱步驟可以縮短分析時間且更為方便[31]，因此通過在家用微波爐中將混合物加熱20 s（約50 ℃）以獲得濁點溫度；使用5 mL pH 3～9的0.01 mol/L緩沖溶液作為水相研究供體相pH值對萃取效率的影響，結果表明VK的萃取效率在供體相pH值為7時達到最大值，pH值增加后稍有下降。值得注意的是，需要用30 μL甲醇稀釋回收得到的富集相（約15 μL），以降低進樣溶液的黏度。綜上所述，可以通過快速、綠色且易于操作CPE萃取過程對VK進行預濃縮。

圖2 萃取變量對CPE效率的影響Fig. 2 Effects of extraction parameters on the extraction efficiency of CPE

2.4 線性范圍、LOD和LOQ結果

應用ANOVA方差分析，比較用乙醇配制標準溶液和以空白基質溶液配制標準溶液校正曲線斜率，以檢查樣品基質效應的相關性。由于2 種維生素基質斜率的差異顯著性P值均高于0.05，證實樣品沒有基質效應，可以使用外標法進行定量。

對CPE結合LC-MS/MS方法的線性范圍、LOD、LOQ進行研究。結果表明通過使用6 個質量濃度水平的峰面積與分析物質量濃度的最小二乘線性回歸分析得到PK和MK在1.0～500.0 ng/mL范圍內的良好線性。在所有處理中，PK和MK校正曲線的線性相關系數均高于0.997 0，PK和MK的LOD和LOQ分別為1.0 ng/g和3.2 ng/g、0.8 ng/g和2.8 ng/g。

2.5 方法重復性和精密度結果

根據重復性要求，在同一天和不同日期分別測定10 次加標量為100 ng/g白蘿卜樣品中PK和MK的重復性，以RSD計算。日內和日間RSD分別為8.8%和9.2%（PK），5.1%和6.3%（MK），表明該方法的精密度良好。

富集因子定義為在萃取相中的分析物濃度與初始樣品中分析物的濃度之比。在CPE萃取條件下，PK和MK的富集因子分別為50、45，表明優化的CPE方法可以對PK和MK進行有效預濃縮。表3比較本實驗方法與文獻報道的測定蔬菜樣品中VK的方法，值得注意的是CPE方法首次用于VK的預濃縮，在靈敏度相當的情況下，與以前使用的常規樣品處理（例如SPE或微型化前處理DLLME和MSPD）方法相比，CPE具有簡單、快速的優點，且避免使用有毒有機溶劑。綜上所述，超聲輔助提取-CPE與LC-MS/MS結合可用于蔬菜中天然VK的含量分析，最大程度地減少樣品處理量和有機溶劑的使用。

表3 蔬菜中VK分析方法的比較Table 3 Comparison of the developed method with other methods proposed for vitamin K analysis in vegetables

2.6 回收率和樣品含量分析

通過2 個不同類型樣品（卷心萵苣和白蘿卜）進行低、中、高3 個添加水平的回收實驗，加標量分別為40、80 ng/g和120 ng/g，結果見表4，3 個水平的回收率證明從加標樣品（白蘿卜和卷心萵苣）中提取VK方法的可靠性，其回收率在94.5%～106.2%之間，RSD在3.3%～8.3%之間（n=6），對于樣品中的VK能提取完全，說明該方法回收率完全能滿足分析要求，結果準確可靠。

表4 加標樣品VK回收率Table 4 Recoveries of spiked samples

表5 蔬菜樣品中的VK含量Table 5 Vitamin K contents in the analyzed vegetables

圖3 混合標準溶液（A）和綠色蔬菜樣品（B）PK和MK總離子色譜圖及其離子豐度圖Fig. 3 Total ion current chromatograms (TIC) and ion abundance obtained for PK and MK standard mixed solutions (A) and green vegetables samples (B)

通過超聲輔助提取-CPE聯合LC-MS/MS方法對8 種不同蔬菜的PK和MK進行測定。結果表明卷心萵苣、上海青、菊苣、羽衣甘藍、菠菜和水芹菜的PK含量為96.2～1 704.5 ng/g（表5），白蘿卜和胡蘿卜樣品中VK含量低于其相應的LOD，所有蔬菜樣品均未檢測到MK，表明綠葉蔬菜是VK的良好來源，而根莖類蔬菜中VK含量極低，這與PK主要存在于綠葉蔬菜和植物油中，而MK主要存在于肉類、乳制品和發酵食品中的報道一致[1,5]。如圖3所示，標準溶液中的MK和PK保留時間分別為7.31 min和8.98 min，相對離子豐度比分別為0.123 6和0.247 0，而樣品中的MK和PK的保留時間和相對離子豐度比與標準溶液一致，符合定性要求，證明樣品中所測的分析物確為目標物。

3 結 論

本實驗建立超聲輔助提取-CPE聯合LC-MS/MS測定蔬菜中2 種天然VK同系物（PK和MK）的檢測方法。應用該方法同時測定8 種常見蔬菜中天然VK同系物的含量。結果表明：該方法操作簡單、綠色環保、處理樣品量少、結果準確、重復性好，該方法可同時測定PK和MK的含量，且具有回收率高、精密度和靈敏度好等特點。方法對卷心萵苣、上海青、菊苣、羽衣甘藍、菠菜、水芹菜、白蘿卜和胡蘿卜8 種蔬菜樣品進行檢測，檢測結果表明蔬菜中僅含有PK，其中白蘿卜和胡蘿卜未檢測到PK，菠菜中含量最為豐富，達1 704.5 ng/g。綜上所述，方法應用于日常檢測中可降低檢測成本，對環境友好，能滿足果蔬中天然VK的分析要求，可為政府行政監督提供檢測技術支持，具有實際應用價值。