盤縣火腿深度腐敗的微生物及揮發性風味化合物表征

母 雨，蘇 偉,*，母應春

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

干腌火腿是一種傳統發酵肉制品，有數千年的消費歷史。已經證明干腌火腿富含多種營養物質并具有潛在健康益處[1-2]。盤縣火腿是我國著名干腌火腿之一，于2012年獲得“國家地理標志”稱號[3]。它的加工工藝包括鮮腿老化、腌制、堆碼翻壓、靜置和成熟，周期長達12～24 個月，長時間的成熟和獨特的地理環境賦予其鮮明的品質特征。然而，盤縣火腿的生產采用自然發酵，且不使用任何防腐劑，其穩定性完全依賴于鹽的滲透和成熟過程的脫水。因此，一些腐敗微生物很可能在加工早期生長繁殖，并最終導致產品的腐敗變質。

干腌火腿的變質是一個長期性、世界性的難題。據報道，西班牙每年有大約3 000萬 只火腿腐敗變質，造成的經濟損失高達數千萬美元[4]。干腌火腿常見的腐敗類型有“深度腐敗”和“靜脈缺陷”。其中，“深度腐敗”是最重要的一種變質類型，其特征是糊狀質地和令人討厭的臭味，這種臭味常見于鄰近骨骼結構的大塊肌肉中[5]。研究認為這種類型的腐敗是由微生物菌群，特別是細菌造成的，且已基于培養法分離出相應菌株[6]。“靜脈缺陷”屬于表層腐敗，腐敗區域通常具有較高的鹽含量，已從此類腐敗中培養分離出一些嗜鹽菌，如肉桿菌（Carnobacterium）、棒狀桿菌（Corynebacterium）、弧菌（Vibrio）和海生乳桿菌（Marinilactibacillus）[7-8]。然而，由于可存活但不可培養狀態，培養法僅能分離出完整微生物種群的一部分[9]。相比之下，高通量測序可以對復雜的微生物群進行更深入、更精確的評估，已用于揭示干腌火腿的群落組成[10]。此外，由于“深度腐敗”的主要缺陷在于異味，采用固相微萃取結合氣相色譜-質譜（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）法檢測腐敗火腿的標志性風味。

本研究旨在表征與盤縣火腿“深度腐敗”有關的微生物和揮發性風味，其豐度和含量可用作確定盤縣火腿變質的指標，有助于發現和控制早期的腐敗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

盤縣火腿樣品（正常和腐敗火腿各3 只）由貴州省盤州市火腿加工廠提供，所有樣品均取自相同工藝、環境下生產的同一批次火腿。為盡可能減少影響因素，正常火腿取樣部位與腐敗火腿一致。取樣完成后立即裝入無菌袋，并置于低溫泡沫盒中12 h內送回實驗室，貯存于-80 ℃直至分析。

Power Soil?DNA提取試劑盒 美國MP Bio公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；DNA聚合酶 大連寶生物工程有限公司；正反引物 深圳市英俊生物技術有限公司；DNA純化磁珠 南京諾唯贊生物科技有限公司；MinElute?聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）純化試劑盒 德國Qiagen公司。

1.2 儀器與設備

Veriti? 9902 PCR儀 美國ABI公司；Nanodrop 2000超微量分光光度計、Trace1300-TSQ8000 GC-MS聯用儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；Illumina MiSeq測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指標的測定

水分含量測定：利用直接干燥法；鹽含量測定：采用GB 5009.44—2016《食品中氯化物的測定》方法；水分活度（aw）測定：水分活度儀；pH值測定：pH計。所有實驗重復3 次。

1.3.2 高通量測序

1.3.2.1 總DNA提取與PCR擴增

每個樣品在無菌條件下取10 g并充分研磨，然后根據說明書使用Power Soil DNA試劑盒提取樣品總DNA。DNA的質量和數量以OD260nm/OD280nm和OD260nm/OD230nm的比值進行評估。然后將DNA保存在-80 ℃，直到進一步處理。利用引物（338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）結合適配器序列和條形碼序列擴增細菌16S rRNA的V3-V4區。

PCR擴增體系的總量為50 μL，包括10 μL緩沖液、0.2 μL Q5 High-Fidelity DNA聚合酶、10 μL高GC增強劑、1 μL核苷酸、正反引物各10 μmol/L和60 ng的基因組DNA。擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共15 個循環；72 ℃擴展7 min。利用VAHTSTM DNA磁珠純化第1輪PCR擴增產物。第2輪PCR擴增體系為40 μL，包括20 μL 2×Phusion HF MM、8 μL ddH2O、正反引物各10 μmol/L以及第1輪擴增的PCR產物10 μL。擴增程序為：95 ℃預變性30 s；98 ℃變性10 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10 個循環；72 ℃擴展5 min。利用PCR純化試劑盒對瓊脂糖凝膠回收的PCR產物進行純化，然后用Nanodrop 2000超微量分光光度計定量并按每個樣本的測序要求進行混合，最后使用Illumina HiSeq 2500平臺對純化的混合樣本進行細菌rRNA基因的高通量測序分析。

1.3.2.2 測序數據處理

根據雙端測序之間的overlap關系，利用FLASH v1.2.7軟件，通過overlap對每個樣品的序列進行拼接，得到的拼接序列即原始序列數據；然后利用Trimmomatic v0.33軟件對拼接后的原始數據進行過濾，得到高質量的序列數據；最后，使用UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到有效數據。利用QIIME v1.8.0對有效數據在97%的相似度水平下進行聚類、獲得操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），并基于Silva分類學數據庫對OTU進行分類學注釋，設置比對閾值為70%。

1.3.3 揮發性風味化合物分析

1.3.3.1 風味化合物的提取與檢測

參照Maru?i?等[11]的方法提取和檢測揮發性風味化合物，并略作修改。準確稱取5.00 g切碎的火腿樣品置于25 mL飽和食鹽水中，均質2 min以制備火腿勻漿。取10 mL勻漿置于20 mL頂空瓶中并用PTFE隔膜蓋緊，然后使用已老化的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在40 ℃振搖提取180 min。萃取完成后，立即將SPME纖維插入進樣口，在230 ℃解吸5 min。

色譜條件：毛細管柱為DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min，不分流模式。柱升溫程序：50 ℃保持5 min，然后以5 ℃/min的速率升至200 ℃，最后以20 ℃/min的速率升至250 ℃并保持10 min。

質譜條件：電子電離源，電子能量為70 eV，傳輸線和離子源溫度為280 ℃和230 ℃，掃描范圍m/z50～450，掃描速率為1 scan/s。

1.3.3.2 風味化合物的定性與定量

定性：實驗結果與NIST數據庫進行比對，僅保留正反匹配度均大于800的化合物。在相同的色譜條件下運行C6～C30正構烷烴混合標品，以計算化合物的保留指數（retention index，RI）。計算公式如下：

式中：Rt（x）、Rt（n）及Rt（n＋1）分別為待測揮發性成分、含n個碳原子正構烷烴及（n＋1）個碳原子正構烷烴的保留時間。

定量：峰面積歸一化法。

1.4 數據分析

SPSS Statistics 20.0用于數據的統計分析，數據均以表示，利用單因素方差分析確定顯著性（P＜0.05）。基于獲得的OTU表格，利用QIIME計算樣品的α多樣性，包括豐富度指數（ACE和Chao1）和多樣性指數（Shannon和Simpson）。揮發性風味化合物的LEFSe（LDA Effective Size）分析在Galaxy網站上進行（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/）。環境因子與細菌屬之間的冗余分析（redundancy analysis，RDA）基于R v3.6.1軟件的vegan包執行。基于Pearson相關系數（r＞0.7，P＜0.05）建立微生物屬與揮發性風味物質間的相互關系，并利用Cytoscape v3.2.1軟件進行網絡可視化。

2 結果與分析

2.1 物理化學特性

表1 正常與腐敗盤縣火腿理化特性Table 1 Physicochemical characteristics of normal and spoiled Panxian hams

如表1所示，腐敗火腿的pH值、aw、水分含量顯著高于正常火腿，而NaCl含量顯著低于正常火腿（P＜0.05）。Blanco等[4]在腐敗西班牙火腿中發現了類似的情況。人工上鹽易導致鹽分布和滲透不均勻，因此低NaCl含量可能與腌制工藝有關。較高的pH值是產品變質的指標之一，腐敗火腿中pH值的上升可能與其較低的鹽含量有關。據報道，鹽質量分數5%～6%即可抑制肌肉組織蛋白酶活力，因此，較低濃度的NaCl導致過度的蛋白水解，從而產生糊狀和升高pH值[12]。另外，pH值越高持水能力越強[13]，這使得腐敗火腿的水分含量高于正常火腿。aw與NaCl含量密切相關，腐敗火腿中較低的NaCl含量導致較高的aw，Losantos等[14]報道了aw的下降對腐敗干腌火腿中腸桿菌科微生物的抑制作用。

2.2 細菌多樣性分析

利用Illumina MiSeq平臺從6 個樣品中獲得282 148 個高質量16S rRNA序列，平均每個樣品產生47 024.67 個序列。如表2所示，正常和腐敗火腿在OTU數目和豐富度指數上不存在顯著差異（P＞0.05），但在多樣性指數上存在顯著差異（P＜0.05）。表明腐敗盤縣火腿中存在的細菌種類可能低于正常火腿。另外，正常和腐敗火腿覆蓋率均為0.999，表明該抽樣方案已經基本覆蓋了樣本的細菌多樣性，數據可用于后續分析。

表2 正常與腐敗盤縣火腿的α多樣性分析Table 2 α-Diversity analysis of bacterial communities in normal and spoiled Panxian hams

為進一步了解正常和腐敗火腿的細菌群落結構，在門和屬水平上對測序數據進行分類。在門水平上（圖1A），鑒定出變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。其中，厚壁菌門是正常火腿中的優勢菌門，而變形菌門主導腐敗火腿。在屬水平上（圖1B），僅顯示豐度前10的優勢微生物，分別為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、norank_Enterobacteriaceae、unclassified_Enterobacteriaceae、鹽單胞菌屬（Halomonas）、沙雷氏菌屬（Serratia）、段桿菌屬（Brevibacterium）、色鹽桿菌屬（Chromohalobacter）、涅斯捷連科氏菌屬（Nesterenkonia）、Solitalea和鹽水球菌屬（Salinicoccus）。

圖1 正常和腐敗盤縣火腿在門水平（A）和屬水平（B）上的細菌群落組成Fig. 1 Bacterial community structures of normal and spoiled Panxian hams at phylum (A) and genus (B) levels

與大多數干腌火腿一樣[15-16]，葡萄球菌屬是正常火腿中最豐富的。由于較強的外源酶活力，包括蛋白酶、脂肪酶、過氧化氫酶和硝酸鹽還原酶[17]，凝固酶陰性葡萄球菌被認為是肌肉酶之后導致干腌火腿風味、顏色和質地發展的重要因素[18]。鹽單胞菌屬是正常火腿中的次要優勢菌，與之前的報道一致[19]。在腐敗火腿中，腸桿菌科微生物（norank_Enterobacteriaceae、unclassified_Enterobacteriaceae和沙雷氏菌屬）占樣品總豐度的80%以上。腸桿菌科被認為是各類腐敗干腌火腿中的優勢菌群，特別是沙雷氏菌屬和變形桿菌屬（Proteus）[20-21]。Losantos等[14]從腐敗的塞拉諾和伊比利亞火腿中分離出液化沙雷氏菌（S. liquefaciens）和奇異變形桿菌（P. mirabilis），并認為它們的蛋白水解能力可能是臭味形成的原因。類似地，觀察到腸桿菌科微生物與肌鈣蛋白和原肌球蛋白的強烈負相關[6]。

2.3 揮發性風味化合物分析

表3顯示正常和腐敗盤縣火腿的揮發性風味組成。共檢出60 種揮發性風味物質，正常火腿39 種，腐敗火腿34 種。其中27 種為正常火腿獨有，21 種為腐敗火腿獨有。按種類將60 種風味物質分為醛類（23 種）、酮類（13 種）、醇類（6 種）、烴類（6 種）、含苯化合物（6 種）、酸類（2 種）、含硫化合物（2 種）及含氮化合物（2 種）。

表3 正常與腐敗盤縣火腿的揮發性風味物質種類和相對含量Table 3 Types and relative contents of volatile flavor compounds in normal and spoiled Panxian hams

續表3

為進一步篩選正常和腐敗火腿之間的顯著鑒別因子，進行LEFSe分析，閾值設置為LDA＞4，結果如圖2所示。共鑒定出20 種具有顯著差別的鑒別因子，其中正常火腿12 種，腐敗火腿8 種。除酸類和含氮化合物外，其余6大類物質在正常和腐敗火腿之間存在顯著差異。正常火腿含有豐富的醛類和醇類，包括壬醛、己醛、十六醛、辛醛、2-十一烯醛、十五醛、(E)-2-癸烯醛、庚醛和1-辛烯-3-醇；而高含量的烴類、酮類、含苯和含硫化合物是腐敗火腿的特征，特別是苯酚、苯乙醛、二甲基二硫醚、1-十五烯和3-甲基丁酸。

圖2 正常與腐敗火腿中的特征揮發性風味化合物Fig. 2 Characteristic volatile flavor compounds in normal and spoiled Panxian hams

醛類物質可以由脂質氧化和氨基酸的Strecker反應產生，對干腌火腿的整體風味有重要貢獻。在正常火腿中，檢測到23 種醛，占風味物質總面積84.37%，而在腐敗火腿中僅檢出5 種，占總面積的6.05%。正常盤縣火腿中含量較大的醛為壬醛、己醛和十六醛。其中，壬醛和己醛是許多干腌火腿中最豐富的醛類物質，其低氣味閾值有助于增加甜味和青草香氣[22]；而具有肉香味的十六醛是巴馬火腿[23]和伊斯特拉火腿[24]的典型特征。相反，腐敗火腿中的酮類物質在種類和含量（11 種，14.75%）上均高于正常火腿（6 種，1.27%）。García等[25]報道了類似的結果，認為伊比利亞火腿中酮類物質的增加與腐敗微生物的活動有關。另外，酮也可以通過游離脂肪酸的化學自動氧化形成[26]。

醇類物質的形成與脂質氧化、氨基酸代謝、甲基酮還原和微生物繁殖密切相關。與之前的報道不同[27]，醇類物質在正常火腿中的含量高于腐敗火腿。醇類物質的嗅聞閾值通常比醛酮類物質低，但由花生四烯酸氧化形成的1-辛烯-3-醇經常從干腌火腿中檢出，且具有較低的閾值，被認為是盤縣火腿[19]、金華火腿[28]及如皋火腿[29]的特征風味。在本研究中，1-辛烯-3-醇是正常火腿中最豐富的醇，也是正常與腐敗火腿之間的鑒別因子。

烴類物質在種類和含量上的差異也有助于區分正常和腐敗盤縣火腿。正常和腐敗盤縣火腿中的烴類物質分別占樣品風味總面積的0.54%和13.51%。Martín等[27]在未變質（3.98%）和變質伊比利亞火腿（12%）中發現了類似的結果。通常，烴類化合物因其較高的閾值而對火腿風味貢獻較小，但一些烯烴類物質可能會影響整體風味。1-十五烯是腐敗盤縣火腿中的特征化合物，占風味總面積11.05%。據報道，它也是異味薏仁米中最主要的揮發性成分[30]。

含苯化合物是腐敗盤縣火腿中最主要的風味成分，51.66%的峰面積由這類化合物代表。其中，含量較高的苯酚和苯乙醛是腐敗火腿的標志性風味。苯酚是一種具有特殊臭味的化合物，適量的苯酚似乎有助于發酵肉制品的風味[31]，但高含量的苯酚會影響金華火腿的風味[32]。同時，苯酚具有毒性，已被世界衛生組織列入致癌物質清單。苯乙醛是一種具有花香的氨基酸衍生物，經常發現于國內外干腌火腿中[33-34]。然而，高含量的苯乙醛已被認為是伊比利亞火腿腐敗的特征之一[35]。

與之前研究結果一致[19]，在正常盤縣火腿中未檢出含硫化合物。兩種含硫化合物（二甲基二硫醚和二甲基四硫化物）僅存在于腐敗火腿中，占風味總面積的6.52%。硫化物代表燒焦和臭雞蛋的不愉快氣味，通常來自于微生物對含硫氨基酸的降解[36]。如圖2B所示，二甲基二硫醚被鑒定為腐敗盤縣火腿的特征風味化合物。盡管二甲基二硫醚已被描述為金華和如皋火腿的主體風味成分[28-29]，但這類化合物在變質伊比利亞火腿中的含量遠高于未變質火腿[25,35]。

3-甲基丁酸也是腐敗盤縣火腿的特征風味。在伊比利亞火腿中，3-甲基丁酸的氣味被描述為像腳的、酸的和變質火腿的味道，且僅在腐敗火腿中檢測到[35]。腐敗火腿中高含量的3-甲基丁酸可以通過以下兩方面解釋：1）3-甲基丁醛氧化形成3-甲基丁酸；2）腸桿菌科的高蛋白酶活性促進游離氨基酸的釋放，氨基酸通過微生物發酵生成3-甲基丁酸。對于含氮化合物，四甲基吡嗪僅存在于正常火腿中，而N,N-二甲基-4-吡啶僅在腐敗火腿中檢測到。雖然有研究提出應該將一些吡嗪類化合物視為檢測伊比利亞火腿初期腐敗的指標，但不包括四甲基吡嗪[27]。

2.4 環境因子對微生物群落的影響

物理化學性質的改變顯著影響微生物群落的結構和組成。合適的溫度、水分和鹽含量不僅有助于火腿獨特風味的形成，還可以抑制有害微生物的生長繁殖[37]。因此，應用RDA揭示優勢菌屬與環境因子間的關系。銳角表示菌屬與環境因子之間呈正相關，而鈍角表示呈負相關，結果如圖3所示。水分含量、aw和pH值與未分類腸桿菌科微生物呈顯著正相關，而與沙雷氏菌屬（Serratia）的正相關較弱。同時，NaCl濃度顯示出對沙雷氏菌屬的強烈抑制，這種顯著負相關已在腐敗伊比利亞火腿中觀察到[6]。相反，NaCl濃度與其余優勢菌屬呈正相關，特別是色鹽桿菌（Chromohalobacter）和鹽單胞菌（Halomonas）。這兩個屬的大多數成員具有嗜鹽性，經常從高鹽發酵食品中分離出來[38-39]，具有蛋白酶和脂肪酶活性[40]。據報道，色鹽桿菌是韓國醬油品質形成的關鍵[41]，而鹽單胞菌的成員具有降解生物胺的能力[42]。正常火腿中最豐富的葡萄球菌與NaCl濃度的正相關較弱，但與水分含量、aw和pH值呈強烈負相關。類似地，最近一項研究揭示了肉類發酵過程中pH值對葡萄球菌群落結構的顯著影響[43]。

圖3 優勢細菌屬與環境因子之間的RDAFig. 3 RDA of the relationship between dominant bacterial genera and environmental factors

2.5 優勢菌屬與揮發性風味化合物之間的網絡關系

干腌火腿加工過程中伴隨著一系列的生化和酶促反應，包括蛋白質水解、脂質氧化、糖原分解和美拉德反應等，這些反應對火腿風味的形成至關重要。眾所周知，肌肉內源酶，特別是組織蛋白酶主導這些反應，而微生物的酶促作用也有助于風味化合物的產生[44]。據報道，微生物或未知來源的揮發性風味物質占伊比利亞火腿總揮發性化合物的5.7%[29]和6.9%[45]。另外，郇延軍等[46]認為微生物是影響不同等級金華火腿風味的關鍵因素。因此，基于Pearson相關系數構建優勢菌屬與揮發性風味物質之間的相關性網絡。如圖4所示，代表正常火腿的7 種細菌屬和主導腐敗火腿的3 種細菌屬構成兩個單獨的網絡，分別促進32 種和21 種風味化合物的產生。與圖2結果一致，正常火腿以醛類和醇類物質為主，而腐敗火腿以酮類、烴類、含苯和含硫化合物為代表。然而，在圖4A中觀察到苯甲醛和3 種酮的存在。雖然腐敗火腿中更高含量的苯甲醛已被報道[27]，但這種具有苦杏仁和橡子氣味的化合物在干腌火腿中經常發現，并且被認為是伊比利亞火腿的氣味活性成分[47]。如圖4B所示，2 種未知的腸桿菌科微生物與腐敗火腿的5 種特征風味（苯酚、苯乙醛、1-十五烯、3-甲基丁酸和二甲基二硫醚）密切相關，而沙雷氏菌屬只與苯酚、苯乙醛和3-甲基丁酸的產生有關。同時，沙雷氏菌屬僅占腐敗火腿總豐度的8.85%（圖1B）。因此，盡管許多研究認為沙雷氏菌屬是造成干腌火腿腐敗的主要腸桿菌科微生物[6,21]，但它可能并不是導致盤縣火腿腐敗的關鍵因素。造成這種差異的原因之一可能是此前的研究均采用培養法，大部分微生物無法培養的局限性導致研究者得出值得商榷的結論。有必要應用準確性更高、測序深度更深的宏基因組進行下一步研究。

圖4 優勢細菌屬與揮發性風味化合物的相關性網絡Fig. 4 Correlation network between dominant bacterial genera and volatile flavor compounds

3 結 論

本研究揭示了正常與腐敗盤縣火腿在理化特性、微生物多樣性和揮發性風味物質之間的差異，確定了與腐敗火腿高度相關的幾種特征，即高比例的腸桿菌科和高含量的苯酚、苯乙醛、1-十五烯、3-甲基丁酸及二甲基二硫醚，這對預防和減少盤縣火腿的腐敗具有重要意義。然而，目前基于16S rRNA的高通量測序未能準確鑒定出主導盤縣火腿腐敗的微生物。因此，后續研究中，應該使用基于第3代測序的宏基因組進一步在屬水平和/或物種水平上表征這些微生物，并利用多組學技術（如蛋白組學、轉錄組學和代謝組學）驗證它們與揮發性風味物質之間的關系。