上海進口水產品中副溶血性弧菌耐藥性、毒力基因和遺傳特征

申進玲，趙麗娜,*，韓 偉，許鎮堅，蔣 原,,*，楊捷琳，郭德華，薛 峰

（1.上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心，上海 200135；2.江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，江蘇 南京 210095）

副溶血性弧菌是全球范圍內引起水產類食物中毒的首要病原菌，尤其在中國、日本在內的亞洲國家和美國等地區。副溶血性弧菌在美國每年引起約8萬 例疾病以及100 人死亡[1]，中國臺灣、日本和東南亞近50%的食物中毒事件是由副溶血性弧菌引起[2]。副溶血性弧菌可在水生動物的腸道內黏附、聚集和繁殖，引發水生動物疾病，給海水養殖業帶來巨大損失，亦可引起人類胃腸炎等疾病，嚴重者可引發傷口感染和敗血癥等[3]。溶血素是副溶血性弧菌最主要致病因子，包括不耐熱溶血素（thermolabile hemolysin，TLH）、直接耐熱溶血素（thermostable direct hemolysin，TDH）和TDH相關溶血素（TDH related hemolysin，TRH），分別由tlh、tdh和trh基因編碼。TLH在副溶血性弧菌中高度保守，TDH具有細胞毒性、致死毒性和腸毒性，而TRH具有腸毒性，致病性副溶血性弧菌通常攜帶TDH和TRH中的1 種或2 種。近年來隨著抗生素在水產養殖環節的濫用，細菌耐藥性問題更加劇了副溶血性弧菌的風險。上海口岸進口水產品數量居全國第一，且樣品來自各個國家地區，種類豐富，代表性強。上海及其周邊沿海一帶對水產品的消費量逐年遞增。進口水產品中副溶血性弧菌的存在對我國食品安全和公共衛生帶來極大威脅。研究我國進口水產品中副溶血性弧菌的分布情況、耐藥性、毒力基因和遺傳多樣性，對保障我國人民生命安全和健康具有重大意義。因此本研究擬對不同國家進口水產品中副溶血性弧菌進行耐藥、關鍵毒力基因和多位點序列分型（multi-locus sequence typing，MLST）分析，旨在為進口食品風險科學預警和溯源提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

本研究所用68 株副溶血性弧菌菌株由2017—2019年上海口岸進口的400 份水產品中分離，樣品來自全世界16 個國家（地區），樣品種類涵蓋魚、蝦、貝、蟹等常見海產品和淡水產品等（表1）。所有菌株經生化和分子生物學鑒定確證為副溶血性弧菌。

表1 副溶血性弧菌菌株來源信息Table 1 Information about the sources of Vibrio parahaemolyticus isolates

藥敏實驗所用質控菌株為大腸埃希氏菌標準菌株ATCC25922。分子生物學鑒定所用菌株為副溶血性弧菌標準菌株ATCC33847（tdh＋）和ATCC17802（trh＋）。所用質控菌株均為本實驗室保存。

1.1.2 培養基與試劑

弧菌顯色培養基 法國科瑪嘉公司；3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂 北京陸橋技術股份有限公司；Mueller-Hinton瓊脂、藥敏紙片 英國Oxoid公司；實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）預混液、PCR預混液、DNA Marker DL2000 寶日醫生物技術（北京）有限公司。引物探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設備

Vitek全自動微生物生化鑒定儀（梅里埃）、ABI7500 fast實時熒光PCR儀 美國Applied Biosystems公司；5415R離心機 德國Eppendorf公司；ND-1000分光光度計 美國Nano-Drop科技公司；電泳槽、電泳儀美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株純化與鑒定

使用無菌接種環，將菌株劃線接種至副溶血性弧菌顯色培養基上，37 ℃培養過夜，挑取紫色單菌落，再次劃線接種于3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂上培養過夜。用一次性無菌接種環挑選適量菌落于3 mL無菌生理鹽水中充分混勻，制成麥氏濁度為0.5的菌懸液，使用全自動微生物生化鑒定儀進行鑒定。

1.3.2 DNA模板制備

DNA制備方法采用煮沸裂解法。用無菌槍頭吸取500 μL 1.3.1節菌懸液于1.5 mL離心管中，100 ℃煮沸15 min后，冷卻至室溫，12 000×g離心2 min，取上清液備用。對符合生化實驗的菌株采用PCR方法擴增副溶血性弧菌特異的tlh基因[4]。

1.3.3 藥敏實驗

采用WHO推薦的紙片擴散法。共測試對8 類15 種抗生素的耐藥性。包括青霉素類：氨芐西林（ampicillin，AMP）、阿莫西林（amoxicillin，AMC）、哌拉西林（piperacillin，PRL）；青霉烯類：美羅培南（meropenem，MEM）、亞胺培南（imipenem，IPM）；頭孢類：頭孢他啶（ceftazidime，CAZ）（第3代）、頭孢噻肟（cefotaxime，CTX）（第3代）、頭孢西丁（cefoxitin，FOX）（第2代）；氨基糖苷類：阿米卡星（amikacin，AK）、慶大霉素（gentamicin，CN）；氟喹諾酮類：環丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、左氧氟沙星（levofloxacin，LEV）；氯霉素類：氯霉素（chloramphenicol，C）；四環素類：四環素（tetracycline，TE）；磺胺類：磺胺新諾明（sulfamethoxazole，SXT）。依據美國臨床實驗室標準化協會的標準判定藥敏結果[5]。以大腸埃希菌標準菌株ATCC 25922作為質控菌株。

1.3.4 毒力基因檢測

副溶血性弧菌關鍵毒力基因tdh和trh檢測所用引物探針、real-time PCR體系和條件按照文獻報道進行[4,6]。

1.3.5 MLST分析

表2 副溶血性弧菌MLST PCR擴增和測序引物信息Table 2 Amplification and sequencing primers used in multi-locus sequence typing analysis of V. parahaemolyticus isolates

副溶血性弧菌的7 個管家基因recA、gyrB、dnaE、dtdS、pntA、pyrC、tnaA引物、PCR體系和反應條件參考網絡數據庫（https://pubmlst.org/vparahaemolyticus/info/protocol.shtml），PCR擴增和測序引物序列見表2。PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。采用Bioedit軟件對分離株的每段基因序列與從MLST網站下載的參考菌株序列進行比對，將分離株的基因序列剪切后得到與參考菌株基因相同大小的片段。將經過剪切的每株菌的7 個基因序列按照相同的順序首尾相接，得到3 961 bp的長片段。將所有菌株的3 961 bp片段導入至MEGA 6.06軟件，采用UPGMA方法生成系統發育樹圖。

2 結果與分析

2.1 耐藥結果分析

表3 68 株副溶血性弧菌藥敏實驗結果Table 3 Antimicrobial resistance of 68 V. parahaemolyticus isolates

如表3所示，68 株菌株對LEV和C均敏感，對其余抗生素不同程度地耐藥，耐藥率最高的是AMP，達98.53%，其次是AK（8.82%）、CN（5.88%）、PRL（5.88%）、MEM（4.41%）、SXT（4.41%）。對AMC、IPM、CAZ、FOX的耐藥率較低，均為1.47%。同時，對9 種抗生素中介耐藥，其中氨基糖苷類抗生素中介耐藥率最高，分別達45.59%（AK）、36.76%（CN）。其他中介耐藥率較高的抗生素依次為29.41%（PRL）、20.59%（CIP）、10.29%（FOX），其余抗生素中介耐藥率相對較低（1%～3%）。不同地區和產品來源的菌株耐藥情況未發現有明顯差異。

如表4可知，79.41%的菌株表現出單一耐藥，AMP是主要的耐藥譜，耐受2 種及以上的菌株占20.59%，其中耐受2 種抗生素的耐藥譜較分散，占比14.71%，有4 株耐3 種及以上抗生素，耐藥譜分別為AMP-AK-CN（加拿大鰲蝦F21），AMP-AK-CN-PRL（美國珍寶蟹F14、孟加拉黑蟹F43），AMP-CAZ-SXT-FOX-AMC-PRL-MEM（愛爾蘭面包蟹F64），同時它們也均表現出對2 種抗生素的中介耐藥。38.24%表現為單一中介耐譜，對2 種抗生素中介耐藥的占25.00%，14.71%的菌株表現對3 種及以上的抗生素中介耐藥。

表4 68 株副溶血性弧菌耐藥譜和中介譜分布Table 4 Resistance and intermediate resistance spectrum distribution of 68 V. parahaemolyticus isolates

2.2 毒力基因檢測結果

所有副溶血性弧菌均為tlh陽性。只有來自印度黑蟹的1 株菌株（F108，未知ST型）檢出trh陽性，其余均為陰性，檢出率為1.47%（1/68）。所有菌株tdh檢測結果為陰性。

2.3 MLST分析

MLST分析結果顯示所測試的菌株具有高度遺傳多樣性。68 株菌株共發現65 種ST型，經與pubMLST數據庫比較，只有13 種是已知報道的ST型，分別是ST163、ST423、ST150、ST338、ST340、ST744、ST500、ST2192、ST490、ST338、ST154、ST12、ST424。其余52 種ST型是新發現的，新ST型高達80%。52 種新發現的ST型中，35 株由于一個或多個位點基因突變，不能與pubMLST數據庫完全匹配。

圖1 不同國家不同食品類型來源副溶血性弧菌系統發育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of V. parahaemolytics isolates from various types of food imported from different countries

除了2 株recA不能擴增，其余66 株的親緣關系見圖1。副溶血性弧菌高度多樣化，分別來自菲律賓和印度尼西亞青蟹中的2 株與其他菌株親緣關系較遠。剩余的菌株中，除了越南草蝦中1 株（CXF3）和加拿大珍寶蟹1 株（F62），其余菌株可以分為2 簇：Ia和Ib。5 株歐洲（愛爾蘭、荷蘭、英國）來源的菌株中，4 株位于Ib；5 株來自莫桑比克青蟹的菌株中4 株位于Ia。未發現其他國家（地區）來源的菌株明顯的聚類，如加拿大和美國珍寶蟹、越南草蝦、印度尼西亞和菲律賓的青蟹、印度黑蟹分布均較分散。但發現某些從同一地區不同時間點進境的相同食品類型中的菌株ST型一致或非常接近，且這些ST型未在其他地區出現。如F103和F134均來自加拿大的珍寶蟹，但時間相隔1 個月，分別在2019年3月20日和4月16日進境，同屬于一個未知的ST型；F58和F121均來自莫桑比克的青蟹，分別于2019年2月25日和4月8日進境，同屬于ST338；F18（ST 163）和F79分別來自2018年12月印度尼西亞青蟹和2019年3月馬來西亞青蟹，ST型只存在1 個堿基差異。

3 討論和結論

弧菌一般對人用和獸用的抗生素敏感，但隨著抗生素在人類、農業和水產系統的濫用，副溶血性弧菌也表現出對多種抗生素的耐藥。據文獻報道，副溶血性弧菌對AMP具有較高的耐藥率，本研究測定的副溶血性弧菌對AMP的耐藥率達98.53%，與國內外報道一致[7-10]。Elmahdi等[11]通過分析不同國家的副溶血性弧菌耐藥譜，發現最常耐藥的抗生素為AMP、盤尼西林和TE。本研究尚未發現TE耐藥，但發現近3%菌株對TE中介耐藥。值得注意的是，本研究菌株表現出對多種抗生素的中介耐藥，其中氨基糖苷類抗生素中介耐藥情況最突出，另外PRL、CIP和FOX中介耐藥率也達到10%～30%，與國內外報道一致[7,12-17]。中介耐藥說明菌株正在適應抗生素，需要引起重視。據報道，近年來副溶血性弧菌逐漸出現多重耐藥現象[15,18-20]，本研究也發現上海口岸進口水產品中20.59%的菌株表現出對2 種及以上的抗生素耐藥。值得注意的是，深海水產品中副溶血性弧菌也發現多重耐藥現象，說明抗生素耐藥已經延伸到深海區域，今后應重點關注深海水產品中致病菌的耐藥情況。

分子流行病學表明攜帶tdh和trh基因的副溶血性弧菌產毒株與人類食源性疾病的爆發密切相關，它們在臨床菌株中檢出率高，而在環境和食品中檢出率很低[2,4,21]。于紀棉等[12]報道寧波口岸進口水產品中副溶血性弧菌的tdh和trh攜帶率分別為0.78%和0%，陳廣全等[22]報道北京口岸進口鮮活海產品中副溶血性弧菌tdh和trh攜帶率均為5%，李薇薇等[23]報道我國國家食源性疾病監測網18 個省、自治區、直轄市水產品中副溶血性弧菌tdh和trh攜帶率分別為0%和2.08%，白瑤等[8]報道我國26 個省、直轄市和自治區水產品中分離的1 137 株副溶血性弧菌中tdh和trh檢出率分別為0.3%和1.7%。本研究也發現水產品中副溶血性弧菌trh和tdh攜帶率極低，與以往報道相符[7,24-25]。因此，國內市場和進口水產品中均存在致病性副溶血性弧菌，對我國人民健康帶來隱患，日后需要加強監測。

本研究測試的水產品中副溶血性弧菌菌株呈現高度的遺傳多樣性，與以往研究結果一致[26-28]。經pubMLST數據庫查詢，本研究發現的ST型中，ST338、ST340、ST774均在臨床中報道過，因此這些菌株可能具有致病風險。65 種發現的ST型中，新發現的有52 種。新型如此之多，可能是由于副溶血性弧菌基因組通過突變和重組一直在改變[26,29]。有研究表明，副溶血性弧菌基因組高度重組，被稱為半克隆（semi clonal）群體[30]。由于基因和基因簇在親緣關系較遠或較近的菌株間傳播，因此基于MLST的分型分析較難找到與地域或食品類型高度相關的克隆株[8,17,26]。白瑤等[8]對我國水產品中20 株tdh和（或）trh陽性的副溶血性弧菌PFGE分析結果也顯示，PFGE型別與耐藥譜、地域來源以及食品類別均無明顯關系，但來自河北省的5 株同源性較高。Urmersbach等[26]對來自斯里蘭卡、厄瓜多爾、北海、波羅的海和德國環境和水產品中副溶血性弧菌MLST分析，也未發現ST型與地域之間有明顯關系。本研究基于MLST分析的系統發育樹圖顯示，國家（地區）、食品類別與MLST型和耐藥性并無明顯相關性，但發現某些地區來源的菌株在系統發育樹圖上呈現局部聚集，另外也發現某些ST型分別在相隔數月的時間在來自于同一國家同一食品中出現。這說明，在這些國家可能出現了新的流行克隆株，同時也說明MLST分析在副溶血性弧菌流行病學研究中可以監測并跟蹤新的流行克隆，實現早期預警。

有研究報道recA基因存在重組導致的大量位點突變，因此有學者提出recA不是MLST中的理想位點[31]。本研究也發現在68 株菌株的7 個基因中，recA基因差異性最大，與pubMLST數據庫相比，2 株具有多個位點突變，其他基因突變位點一般為1 個（結果未顯示），另外還有2 株經過多次PCR未能擴增成功。已有不少報道證實，recA擴增不成功是有大片段插入recA基因位點所致，這種插入可對菌株的生物特性產生影響[32-33]。González-Escalona等[32]發現來自弧菌屬的長片段插入秘魯糞便樣品中分離的副溶血性弧菌O4∶K8（菌株編號090-96）的recA中，后經對原始recA基因重建分析發現，其祖先為僅在亞洲出現的ST189，證實了菌株的跨海洋傳播。Chen xiao等[33]在O4∶KUT中發現與菌株090-96同樣的插入片段，基因組分析提示該菌株從O4∶K8進化而來，但插入片段的功能以及與K抗原之間的關系尚未可知。因此未來將對本研究中recA擴增不正常的菌株進行全基因組測序，以揭示插入片段在菌株進化中的作用。

綜上所述，通過對上海口岸進口水產品中副溶血性弧菌進行耐藥性、毒力基因和MLST分析，發現菌株存在中介耐藥和多重耐藥現象，尤其在深海水產品中也出現了多重耐藥；發現某些ST型在臨床中報道過，篩選到攜帶毒力基因的高致病性菌株，這些均具有高風險；發現某些國家可能存在新的流行克隆。這些均需要引起重視，并在今后工作中持續加強監測，以期為我國進口食品風險因子科學預警和溯源提供數據和技術支撐。