牙源性角化囊腫增殖調控基因的篩選

禹雯怡 趙璐 孔憲琛 唐永平 萬梅 邱建忠 袁榮濤

(1 青島大學口腔醫學院，山東 青島 266003； 2 青島大學附屬青島市市立醫院口腔醫學中心)

牙源性角化囊腫(OKC)是一種單囊或多囊的牙源性發育性囊腫[1]，是臨床上較常見的良性頜骨病損，約占牙源性囊腫的10%[2]。OKC可作為單獨病變或痣樣基底細胞癌綜合征(NBCCS)的一部分出現，約5%的病例與NBCCS伴發[3]。OKC是頜骨最具爭議性的病理實體之一，其特征為具有高生長潛力和復發傾向的局部侵襲性病變[4]。刮除術為目前臨床上治療OKC常用的方法，但術后復發率較高；開窗減壓配合二期手術或頜骨節段性切除術可用于較大囊腫的治療，但治療周期較長，患者可能面臨較大的手術創傷，并且術后并發癥較多。揭示OKC發病機制是改進該病治療方法的重要前提，然而其發病的起始因素及其分子機制目前仍不清楚。近年來研究表明，位于染色體9q22.3-q31上抑癌基因Patched(PTCH)突變及其引起的Sonic Hedgehog(Shh)信號通路的異常激活與OKC發病的關聯程度最大[5]。OKC囊壁上皮組織中增殖細胞核抗原(PCNA)及Ki-67表達強度高于含牙囊腫和根端囊腫組織[6]。囊腔內正壓力促進OKC上皮細胞炎性細胞因子白細胞介素-1α(IL-1α)的表達，可能參與了刺激破骨細胞的生成和激活病變周圍骨吸收過程[7]。轉錄組測序技術(RNA-seq)就是采用高通量的測序技術進行測序分析，本研究對利用RNA-seq獲得的數據進行分析，篩選與OKC發生、發展相關的差異表達基因(DEGs)，并進行功能富集和調控網絡分析，以期為OKC的靶向治療尋找潛在作用靶點。

1 資料和方法

1.1 一般資料

2019年1月1日—12月31日在我院口腔頜面外科接受手術治療，病理學證實為原發性非綜合征型OKC患者3例，男2例，女1例；年齡38～67歲，平均54歲。所有患者在標本采集前均未接受任何其他治療。本研究經我院醫學倫理委員會批準通過(#2016-04-28-05)，并征得患者書面知情同意。

1.2 樣品收集和準備

收集3對囊壁和正常口腔黏膜組織(距離囊腫邊緣≥2 cm)標本，離體后立即投入液氮中保存，用于轉錄組測序分析。

1.2.1RNA提取與檢測 使用Trizol法提取組織RNA，Agilent 2100生物分析儀精確檢測RNA完整性，Nanodrop超微量分光光度計檢測RNA濃度和純度。

1.2.2文庫構建與質控 使用Illumina的NEBNext?UltraTM RNA Library Prep Kit生成測序文庫。用附有Poly-T oligo(dT)的磁珠從總RNA中純化mRNA，隨后在高溫下使用二價陽離子在NEBNext第一鏈合成反應緩沖液(5X)中將得到的mRNA進行片段化。然后使用隨機六聚體引物和M-MuLV逆轉錄酶合成第一鏈cDNA，使用DNA聚合酶Ⅰ和RNase H合成第二鏈cDNA，隨后使用AMPure XP beads進行cDNA純化。純化后的雙鏈cDNA進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，采用AMPure XP系統對文庫片段進行純化，篩選長度為240 bp的cDNA片段。最后通過PCR富集方法得到cDNA文庫。

在Agilent 2100系統上評估cDNA文庫質量，insert size符合預期后采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法對文庫有效濃度進行精準定量，其中文庫的有效濃度應大于2 nmol/L。

1.2.3上機測序 文庫質檢完成后，根據目標下機數據量將不同的文庫進行合并，隨后采用Illumina Novaseq平臺進行高通量測序，產生150 bp端讀數。RNA-Seq相關性分析結果表明，樣品間基因表達模式相似度質量評估合格，樣本選擇合理。

1.3 生物信息學分析

測序片段測得的圖像數據經CASAVA堿基識別轉化為序列數據reads，隨后經過過濾得到的數據為Clean Data，并將此數據與指定的參考基因組進行序列比對。根據基因在不同樣品或不同樣品組中的表達量進行差異表達分析，以及DEGs功能注釋、功能富集表達水平分析等，其中DEGs的篩選條件如下：P-value<0.01& |log2(FC)|>1,P-value為差異顯著性P值，FC(Fold Change)為差異倍數。將3對OKC囊壁組織以及正常口腔黏膜組織的DEGs根據樣本的FPKM值進行分層聚類分析，得到聚類熱圖。采用火山圖表示基因整體分布情況，包括上調和下調2.0倍的DEGs及非DEGs。

2 結 果

2.1 基因轉錄本的差異分析

轉錄組測序結果顯示，在3對OKC囊壁與正常口腔黏膜組織中總共檢測到23 609個基因，其中DEGs 359個，上調者169個，下調者190個。

2.2 基因聚類分析

將3對樣本的OKC囊壁和正常口腔黏膜組織的DEGs進行分層聚類分析，得到的聚類圖中可見OKC和正常口腔黏膜組織能夠完整分開(圖1)，表明組內樣本具有較好的重復性，組間對應基因表達的差異性較大。圖中橫坐標為樣品名稱以及樣品的聚類結果，縱坐標為DEGs及基因的聚類結果。顏色表示基因在樣品中的表達量水平log10(gene+0.000 001)，紅色表示對應基因在對應組織中較高表達，綠色表示對應基因在對應組織中較低表達。

①～③：正常口腔黏膜組織，④～⑥：OKC囊壁組織圖1 DEGs聚類熱圖

2.3 差異表達火山圖分析

火山圖展示了基因整體分布情況，OKC囊壁與正常口腔黏膜組織的測序結果包括上調和下調2.0倍的DEGs(P<0.01)以及非DEGs。橫坐標絕對值越大，說明OKC囊壁與正常口腔黏膜組織間的表達量倍數差異越大；隨著縱坐標值增大，差異表達顯著性增加，篩選結果可信度也越高。見圖2。

圖2 DEGs火山圖

2.4 DEGs功能富集分析

使用DAVID數據庫對KEGG通路進行富集分析，結果顯示OKC囊壁和正常口腔黏膜組織相比，注釋在磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路中的DEGs數目最多并且差異具有統計學意義(P<0.01)。見圖3。圖中展示了20個KEGG條目，橫坐標表示DEGs中注釋到該通路的基因比例與所有基因中注釋到該通路的基因比例的比值。即富集因子越大，說明DEGs在該通路中的富集水平越顯著。點的大小、形狀、顏色分別代表注釋在該通路中DEGs的數目、類型和q-value。

圖3 DEGs的KEGG通路富集分析圖

在DEGs的KEGG通路富集點圖(圖4)當中，GeneRatio表示注釋在PI3K-Akt信號通路中的感興趣基因占所有DEGs數的比例最大，在展示前10位中排位第1，15個DEGs。縱坐標為10個KEGG條目，橫坐標表示注釋在該條目中的感興趣基因數與所有DEGs數的比值。點的大小表示DEGs數在該通路中的注釋，點的顏色代表校正后的P值。

圖4 DEGs的KEGG通路富集點圖

3對樣本測序結果富集到PI3K-Akt信號通路中的DEGs為15個，上調者8個，差異倍數由高至低分別為FGF5、IBSP、FGF9、SPP1、IL6、FN1、NR4A1、TNC。下調者7個，差異倍數由高至低分別為GYS2、PRLR、VEGFD、DDIT4L、FGFR3、LAMA3、YWHAB。

3 討 論

基于深度測序的轉錄組分析提高了對DEGs、序列變異和新型融合轉錄本的檢測，是繼基因芯片技術后在基因檢測技術方面的重大突破，因此在癌癥研究中具有廣闊的前景[8]。OKC的發生發展是一個復雜的生物學調控過程，可能存在多基因的突變及異常表達，本研究通過分析OKC囊壁與正常口腔黏膜組織間的基于RNA-seq獲得的數據，以期篩選與OKC發生發展相關的關鍵基因及可能參與的信號通路。

OKC的發病機制尚未明確，一般認為OKC的組織來源為Serres上皮剩余。在牙齒發育完成后這些本應退化而殘留于頜骨內的上皮剩余在不良刺激的誘導下可重獲增殖活性，發生囊性化繼而形成囊腫。還有學者認為其來源于口腔黏膜上皮的基底細胞增殖[7]。目前對OKC的研究包括遺傳學因素、囊壁上皮細胞的增殖與凋亡、囊內液體正壓力作用3個方面[9]。有研究證實PTCH1基因突變及其引起的Hh信號通路的異常激活可能是OKC發病的主要原因，高表達Shh、Smo以及Gli1的OKC可能與NBCCS相關[5]。經典Hh通路(PTCH1-SMO-GLI1)和非經典Hh通路(PTCH1細胞內環通過與CyclinD1結合調控細胞周期)均可能參與OKC病變發生過程[10]。OKC中存在Wnt信號通路相關基因的異常表達，Wnt5a、FZD3、MAPK10、PRKX、CAMK2A可能是通過調控細胞的增殖、分化，在OKC的發生、發展中起著重要作用[11]。表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯(EGCG)可能通過抑制WNT/JNK信號通路而抑制OKC角質形成細胞的增殖和誘導細胞凋亡[12]。最近一些關于牙源性腫瘤的研究表明，OPG/RANK/RANKL信號通路參與了OKC引起的骨吸收過程，開窗減壓治療可促進OKC附近骨的再生[13]。

本研究利用RNA-seq測序總共獲得了359個DEGs，其中169個上調，190個下調，表明樣本中基因組轉錄本具有顯著的差異。KEGG通路富集分析表明，PI3K-Akt信號通路中的DEGs數目最多且差異具有統計學意義，檢測到的15個DEGs可能為OKC潛在的生物標志物。PI3K-Akt信號轉導通路通過影響下游多種效應分子的活化狀態，參與腫瘤細胞的生存、增殖、周期進展、生長、遷移和血管生成等過程[14]。參與PI3K-Akt信號通路的調節因子主要為負調節因子，包括PTEN、SHIP2等。MiR-21通過PTEN/PI3K/Akt通路調控卵巢癌細胞的增殖和凋亡[15]。下調SHIP2基因，可通過PI3K-Akt通路增強喉鱗癌放射敏感性[16]。COX-2通過PI3K/Akt/NF-κB信號通路促進骨肉瘤MG-63細胞的上皮-間充質轉化以及遷移過程[17]。富集至PI3K-Akt信號通路中的DEGs中變化倍數最顯著的GYS2，其在肝細胞癌中的表達亦顯著下調；敲低GYS2通過調節p53的表達，可促進細胞增殖和腫瘤生長，證明了GYS2通過與p53的負反饋回路抑制乙肝病毒相關性肝癌的生長[18]。在氧-葡萄糖剝奪/復氧模擬的腦缺血-再灌注損傷過程中，miR-145-5p可通過負調控FGF5促進神經細胞的凋亡和損傷[19]。

本研究中OKC囊壁組織中FGF9表達上調。研究顯示，相比于癌旁組織，胃癌組織中FGF9基因表達上調，且FGF9通過激活ERK和Akt信號通路增強胃癌細胞抗凋亡能力[20]。新型長鏈非編碼RNA-FAF通過PI3K/Akt信號通路上調FGF9基因表達，進而抑制缺血缺氧心肌細胞的凋亡[21]。沉默SPP1基因，可通過參與PI3K/Akt信號通路抑制舌癌的進展[22]。研究發現，IL-6的異常和過度分泌可能導致嚴重的炎癥反應,PI3K/Akt通路的激活對IL-6反式信號介導的人血管內皮細胞促炎癥反應至關重要[23]。天然二苯乙烯類化合物在體內具有抗炎作用，并且可能以PI3K/Akt依賴的方式下調IL-6的產生[24]。

Akt/mTOR通路在癌癥中的作用眾所周知，但很少有研究評估該信號通路在良性病變中的重要性。有研究發現Akt/mTOR通路在OKC組織中表達上調，該通路可能參與了病變的發生發展[25]。考慮到該信號通路在調控細胞增殖中的作用，可以解釋為什么OKC表現出高水平的細胞增殖活性、侵襲性以及復發傾向。全基因組芯片分析OKC轉錄組特征，聚類分析結果提示有兩個不同的分子亞型，Akt通路在一種亞型中被激活，MAP激酶通路在另一種亞型中被激活[26]。此外，PTCH1在兩個亞型中表達均下調，表明其可能參與了OKC病變的進展。SHH/PTCH是一個已明確參與OKC發病機制的信號通路，在某些癌癥中，SHH/PTCH可以通過Akt/mTOR通路促進細胞遷移、侵襲以及轉移[27-28]。

總之，在本研究中篩選獲得的DEGs，其中一些已經被認為是腫瘤的潛在生物標志物。研究OKC發病機制中所涉及的信號通路對于疾病的非手術治療很重要。OKC中存在PI3K/Akt信號通路相關基因的差異表達，且注釋在該信號通路中的感興趣基因占所有DEGs數的比例最大，但目前的研究有一定的局限性，尚需要增加樣本量及進一步的研究來闡明這些基因在OKC中的調控作用，并最終為OKC的靶向治療尋找潛在作用靶點。