藻藍蛋白對小鼠精原細胞氧化損傷的保護作用及其機制

董曉雷 韓晶晶 楊方浩 朱峰 劉國祥 李冰

(青島大學基礎醫學院遺傳學與細胞生物學系，山東 青島 266071)

由于環境惡化、生活壓力大等因素的影響，人群中不孕不育發病率逐漸增高[1-2]，給患者家庭造成極大的困擾。男性不育主要表現在睪丸組織氧化損傷，其中精子數量降低、活動力下降等為主要影響因素。目前常用的改善生殖性能的藥物副作用大，從海洋中尋找改善生殖性能且毒副作用小的天然藥物成為關注的熱點。螺旋藻中藻藍蛋白(C-PC)含量豐富，具有抗氧化、抗腫瘤等功效[3-6]，但其在生殖免疫領域作用的研究較少。活性氧(ROS)是由生物系統代謝產生的一類能夠引起機體發生氧化反應的物質[7-9]，其主要包括有超氧自由基、羥基自由基等。當細胞內ROS產量增加時，會導致蛋白質、脂質和核酸損傷，對細胞結構產生有害的作用[10]。研究表明，細胞中ROS累積可導致細胞骨架紊亂[11]、抗氧化系統功能障礙[12-13]和細胞凋亡[14]。生殖細胞在正常代謝過程中產生ROS并逐漸累積而導致氧化應激的發生，從而導致生殖細胞的損傷，降低了生殖細胞的質量和數量，影響胚胎發育[15]。氧化應激被認為是潛在的細胞老化的主要機制之一[16-17]，其對人類生殖過程的負面影響不再是爭論的話題[18]。本研究擬觀察C-PC對H2O2誘導的小鼠精原細胞GC-1 spg氧化損傷的保護作用及其機制，旨在為C-PC在生殖免疫領域的開發利用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

C-PC購自臺州賓美生物技術有限公司；小鼠精原細胞GC-1 spg購自武漢普諾賽生命科技有限公司；DMEM培養基購自美國Hyclone公司；胎牛血清、胰蛋白酶消化液購自美國BI公司；青鏈霉素混合液購買于北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白質定量試劑盒購自中國biosharp公司；H2O2購自美國Sigma公司；Annexin V-PI細胞凋亡檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；RIP-1購自成都正能生物技術有限責任公司；RIP-3購自美國Santa公司。

1.2 細胞培養及處理

GC-1 spg接種于含體積分數0.10胎牛血清和體積分數0.01青鏈霉素溶液的高糖DMEM培養基中，置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的細胞培養箱內培養。實驗時將細胞分為對照組(A組)、模型組(B組)、C-PC低劑量組(C組)、C-PC中劑量組(D組)以及C-PC高劑量組(E組)。調整GC-1 spg密度為7×107個/L，然后將細胞接種于96孔(每孔100 μL)或6孔培養板(每孔2 mL)中，細胞過夜貼壁后，A組和B組加入培養液常規培養，C、D、E組分別加入0.25、0.50、1.00 g/L C-PC預處理24 h，A組去除培養液換成新鮮培養液，B、C、D、E組去除培養液，加入含600 μmol/L H2O2的新鮮培養液繼續培養24 h，然后進行后續實驗。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖率

各組細胞經處理后，吸出培養基，加入110 μL含體積分數0.10 CCK-8的培養基，繼續培養2 h后，應用酶標儀測定450 nm波長處的吸光度(A)值。并計算細胞增殖率。細胞增殖率(%)=(實驗組A-空白組A)/(對照組A-空白組A)×100%。

1.4 DCFH-DA染色測定細胞內ROS水平

按照1∶1 500用無血清培養液稀釋二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)熒光探針，并使終濃度為7.5 μmol/L。各組細胞經處理后，棄掉培養基，6孔板中每孔加入1 mL已稀釋好的DCFH-DA，37 ℃下置于細胞培養箱內孵育20 min。用無血清細胞培養液洗滌細胞3次，加入無血清細胞培養液并在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光強度。

1.5 流式細胞術檢測細胞壞死率

各組細胞經處理后，棄掉培養基，用不含EDTA的胰酶消化，離心收集細胞，用預冷PBS洗滌2次，離心收集細胞。加入100 μL結合緩沖液重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI Staining Solution，混勻，室溫避光孵育15 min，再加入400 μL結合緩沖液。混勻置于冰上，立即用流式細胞儀進行分析。

1.6 Western blot方法檢測細胞中RIP-1、RIP-3的表達

各組細胞經處理后，棄掉培養基，用預冷PBS洗滌細胞3次，每組加入200 μL蛋白裂解液(按照RIPA∶PMSF∶IP按100∶1∶1的比例配制)，提取細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度。在SDS-PAGE上分離蛋白質，并將其轉移到PVDF膜上，用TBST配制的50 g/L脫脂奶粉封閉2 h。將該膜在4 ℃下與一抗(1∶1 000)孵育12 h，以GAPDH(1∶2 000)作為內參照。將膜用TBST清洗3次，每次10 min。二抗(1∶1 000)在室溫下孵育2 h以后，TBST清洗3次，每次10 min。ECL發光顯影。使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對表達量以目的蛋白灰度值/內參照蛋白灰度值計算。

2 結 果

2.1 各組GC-1 spg增殖活性測定

CCK-8法檢測結果顯示，A、B、C、D、E組細胞的增殖活性分別為(100.00±5.09)%、(64.91±4.75)%、(76.25±4.94)%、(78.69±8.54)%和(84.20±6.36)%。B組細胞活性低于A組(F=76.86，q=23.01，P<0.05)，C、D、E組細胞活性均高于B組，差異均有顯著意義(q=4.45～10.83，P<0.05)。

2.2 C-PC對GC-1 spg內ROS水平的影響

熒光顯微鏡下觀察可見，與A組相比，B組細胞內綠色熒光強度明顯升高；與B組相比，C、D、E組細胞內的綠色熒光強度明顯降低(圖1)。

2.3 C-PC對H2O2誘導的GC-1 spg壞死的影響

流式細胞術檢測結果顯示，A～E組細胞壞死率分別為0.004±0.001、0.195±0.004、0.166±0.002、0.153±0.003、0.092±0.003。與A組比較，B組壞死細胞明顯增加(F=206.90，q=60.07，P<0.05)；C、D、E組壞死細胞均較B組明顯減少，差異均具有統計學意義(q=9.09～32.41，P<0.05)。見圖2。

①：A組，②：B組，③：C組，④：D組，⑤：E組圖1 各組GC-1 spg內ROS水平比較

①：A組，②：B組，③：C組，④：D組，⑤：E組圖2 流式細胞術檢測各組GC-1 spg的壞死率

2.4 C-PC對H2O2誘導的GC-1 spg壞死相關蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，A～E組細胞內RIP-1蛋白的相對表達量分別為1.013±0.014、1.947±0.038、1.140±0.021、0.877±0.017、0.517±0.012。RIP-3蛋白相對表達量分別為0.930±0.012、1.623±0.052、0.883±0.015、0.603±0.015、0.430±0.015。與A組相比，B組細胞中RIP-1、RIP-3蛋白相對表達量明顯升高，差異均有顯著性(F=541.2、297.5，q=41.11、26.21，P<0.05)；與B組相比，C、D、E組細胞中RIP-1、RIP-3蛋白相對表達量明顯降低，差異均具有顯著性(q=27.97～62.98，P<0.05)。見圖3。

3 討 論

眾所周知，氧化應激對人體健康有害，從而導致一些疾病的發生，如心血管疾病、神經系統疾病、腎臟疾病、性成熟的延遲等[19-21]。ROS過量累積使細胞發生氧化應激，該機制已被認為是導致女性子宮內膜異位癥、卵巢癌、多囊卵巢等其他各種常見疾病的潛在影響因素，也是誘導男性精子DNA損傷和精子凋亡的潛在誘因[22]。由于氧化應激被認為是潛在老化的主要機制之一[16-17]，降低生殖細胞氧化應激反應可有效增強生殖細胞的活力。研究表明，C-PC是一種有效的過氧自由基清除劑[23]。本研究中，GC-1 spg經H2O2處理后，細胞存活率顯著降低，壞死率升高，C-PC各劑量組處理可以提高細胞活力和降低壞死率，將損傷逆轉到正常狀態。表明C-PC預處理可以保護GC-1 spg免受H2O2的氧化損傷。

①：A組、②：B組、③：C組、④：D組、⑤：E組圖3 Western blot方法檢測各組GC-1 spg中RIP-1、RIP-3蛋白的表達水平

ROS在調控細胞各種功能中扮演著重要角色，正常情況下細胞內的穩態通過內源性自由基或抗氧化防御系統來平衡[24-25]。然而，ROS過量最終會導致抗氧化機制失衡，進而誘導細胞發生氧化損傷。其中細胞經H2O2處理后，細胞內會產生過量的ROS，導致細胞抗氧化能力降低[26]。為了闡明C-PC可以逆轉GC-1 spg氧化損傷，本研究對H2O2處理的GC-1 spg內ROS水平進行檢測。本研究結果表明，H2O2誘導GC-1 spg損傷后細胞內ROS水平較對照組顯著升高；與模型組相比，C-PC低、中、高劑量組可有效降低細胞內ROS水平。這些結果表明，C-PC通過降低細胞內ROS水平來降低氧化應激。

程序性壞死是近年來發現的一類受死亡信號的調控、非依賴Caspase的新型細胞死亡方式[27]，受體相互作用蛋白RIP是其中的關鍵組分，是反映程序性壞死的重要指標。程序性壞死抑制劑Nec-1作用于RIP-1和RIP-3的激酶部分發揮作用。HANUS等[28]證實，細胞發生氧化應激后，核膜和質膜會遭到破壞，細胞內ATP耗竭等，這是程序性壞死的主要特征。RIP-3敲除或使用RIP的抑制劑Nec-1可挽救氧化應激引起的細胞死亡，表明RIP對氧化應激誘導細胞發生程序性壞死至關重要。最近的研究表明，程序性壞死也是視網膜色素上皮細胞在氧化應激下死亡的主要機制[28-29]。

本研究利用H2O2建立GC-1 spg氧化損傷模型，結果表明H2O2誘導了GC-1 spg發生程序性壞死，RIP-1、RIP-3是H2O2誘導的細胞程序性壞死的關鍵分子，說明RIP-1、RIP-3介導的程序性壞死參與了H2O2誘導的GC-1 spg氧化損傷。

細胞水平證實，H2O2在引起GC-1 spg損傷的同時，可上調RIP-1、RIP-3蛋白的表達水平。說明C-PC預處理GC-1 spg能抑制H2O2誘導的RIP-1、RIP-3蛋白表達上調，同時能顯著抑制H2O2引起的細胞損傷，使細胞存活率升高，降低細胞內ROS生成。因此，抑制程序性壞死可能是C-PC保護GC-1 spg的另一個重要機制。

綜上所述，本研究初步認為H2O2誘導了GC-1 spg氧化損傷和RIP-1、RIP-3介導的細胞程序性壞死。這項研究表明，C-PC對H2O2誘導的GC-1 spg氧化損傷具有明顯的保護作用，其作用可能與C-PC顯著降低GC-1 spg內ROS水平，下調壞死通路蛋白RIP-1、RIP-3的表達水平，降低細胞壞死率，從而具有抑制氧化應激誘導的程序性壞死的能力有關。該研究為C-PC在生殖領域的開發利用提供了理論依據，具有較好的臨床應用前景。