腎透明細(xì)胞癌CYP4A11、Ki-67表達(dá)及與患者臨床病理特征的關(guān)系

楊丹丹 何冰 盧曉 郭芷含 李玉軍

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，山東 青島 266003)

腎透明細(xì)胞癌起源于近曲小管，是成人腎臟原發(fā)惡性腫瘤中最常見(jiàn)的類(lèi)型[1]。雖然根治或部分腎切除術(shù)以及靶向治療等在腎透明細(xì)胞癌患者治療中取得顯著效果，但仍有部分患者會(huì)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移甚至死亡[2]。了解腎透明細(xì)胞癌獨(dú)特的代謝途徑是診斷和治療腎透明細(xì)胞癌的關(guān)鍵[3]。因此，對(duì)腎癌發(fā)生機(jī)制進(jìn)行研究，尋找新的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)對(duì)改善腎透明細(xì)胞癌患者的預(yù)后具有重要意義。細(xì)胞色素P450 4(CYP4)家族是由CYP4A和CYP4F兩種亞型組成，它們催化所有形式的脂肪酸的ω-羥基化[4]。其中，CYP4A亞型在炎癥的激活和消解中具有雙重作用，并介導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)和血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物類(lèi)二十烷酸(20-HETE)的形成[5]。研究發(fā)現(xiàn)，CYP4A11是CYP家族的主要成員之一，受PPARα調(diào)控，在人體肝臟和腎臟中含量最高[6]。Ki-67是一種參與核糖體RNA轉(zhuǎn)錄的核蛋白，目前常被作為細(xì)胞增殖活性的敏感指標(biāo)。研究表明，Ki-67的表達(dá)與腫瘤的侵襲性及惡性程度相關(guān)，可用來(lái)評(píng)價(jià)腫瘤生物學(xué)行為[7]。本研究旨在觀察CYP4A11及Ki-67在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況及相關(guān)性，并探討其與臨床病理學(xué)因素及患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

收集我院2010年1月—2015年12月手術(shù)切除的151例腎透明細(xì)胞癌的組織標(biāo)本，另取48例癌旁組織標(biāo)本作為對(duì)照。所有納入的病例標(biāo)本均為原發(fā)病灶，術(shù)前均未接受放化療。納入本研究的151例患者中，男95例，女56例；年齡28～87歲，平均年齡58.04歲，中位年齡59歲；腫瘤最大徑≤7 cm 127例，>7 cm 24例；WHO/ISUP核分級(jí)：Ⅰ級(jí)～Ⅱ級(jí)76例，Ⅲ級(jí)～Ⅳ級(jí)75例；臨床分期Ⅰ期～Ⅱ期126例，Ⅲ期～Ⅳ期25例；未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移129例，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移22例。

1.2 抗體與試劑

兔抗人多克隆CYP4A11抗體(克隆號(hào)ab3573，稀釋度1∶200)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，Ki-67抗體(工作液)購(gòu)自丹麥DAKO公司，其他試劑(工作液)為瑞士ROCHE公司產(chǎn)品。

1.3 檢測(cè)方法

使用ROCHE VENTANA全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)檢測(cè)腎透明細(xì)胞癌組織中CYP4A11及Ki-67的表達(dá)，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判讀

CYP4A11免疫組化檢測(cè)結(jié)果采用Histoscore法進(jìn)行評(píng)分[8]。Ki-67指數(shù)判讀按照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)[2]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。CYP4A11在癌與癌旁表達(dá)比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)；CYP4A11及Ki-67的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)；CYP4A11與Ki-67相關(guān)性應(yīng)用Spearman等級(jí)分析；采用Cox回歸分析進(jìn)行生存分析，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 CYP4A11在腎透明細(xì)胞癌和癌旁組織中的表達(dá)情況

腎透明細(xì)胞癌組織中CYP4A11定位表達(dá)于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)(圖1A)，在腎透明細(xì)胞癌伴肉瘤樣變區(qū)域中CYP4A11定位表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)(圖1B)，在癌旁組織中定位表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)(圖1C)。151例腎透明細(xì)胞癌組織中，51例呈高表達(dá)，100例呈低表達(dá)，而48例癌旁組織中，27例呈高表達(dá)，21例呈低表達(dá)，兩者比較差異有顯著性(Z=-2.100，P<0.05)。

2.2 CYP4A11表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系

151例腎透明細(xì)胞癌中低級(jí)別腎透明細(xì)胞癌76例，高級(jí)別腎透明細(xì)胞癌75例。CYP4A11在低級(jí)別腎透明細(xì)胞癌中低表達(dá)60例，高表達(dá)16例，在高級(jí)別腎透明細(xì)胞癌中低表達(dá)40例，高表達(dá)35例。高級(jí)別腎透明細(xì)胞癌組織中CYP4A11的高表達(dá)率要顯著高于低級(jí)別腎透明細(xì)胞癌(χ2=11.072，P<0.05)。

A：CYP4A11在腎透明細(xì)胞癌中呈低表達(dá)，B：CYP4A11在腎透明細(xì)胞癌及伴肉瘤樣變區(qū)域中呈高表達(dá)，C：CYP4A11在癌旁組織中呈高表達(dá)。En Vision法染色，200倍圖1 CYP4A11在腎透明細(xì)胞癌及癌旁組織中的表達(dá)

CYP4A11的表達(dá)與患者性別及腫瘤最大徑、臨床分期、肉瘤樣變以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(χ2=4.438～10.930，P<0.05)；而與患者年齡無(wú)關(guān)。見(jiàn)表1。

2.3 Ki-67表達(dá)及其與腎透明細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系

Ki-67在低級(jí)別腎透明細(xì)胞癌中低表達(dá)69例，高表達(dá)7例，在高級(jí)別腎透明細(xì)胞癌中低表達(dá)34例，高表達(dá)41例。Ki-67在高、低級(jí)別腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)差異有顯著意義(χ2=35.971,P<0.05)。

Ki-67的表達(dá)與腫瘤最大徑、臨床分期、肉瘤樣變、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(χ2=4.365～10.833，P<0.05)；而與患者性別、年齡無(wú)關(guān)。見(jiàn)表1。

表1 腎透明細(xì)胞癌CYP4A11及Ki-67表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

2.4 CYP4A11與Ki-67表達(dá)的相關(guān)性

151例腎透明細(xì)胞癌中，CYP4A11和Ki-67均高表達(dá)者26例，CYP4A11高表達(dá)Ki-67低表達(dá)者25例，CYP4A11低表達(dá)Ki-67高表達(dá)者22例，CYP4A11和Ki-67都低表達(dá)者78例。Spearman相關(guān)性分析顯示，腎透明細(xì)胞癌組織中CYP4A11與Ki-67表達(dá)呈顯著正相關(guān)(rs=0.231，P<0.05)。

2.5 腎透明細(xì)胞癌組織中CYP4A11及Ki-67表達(dá)與患者總生存時(shí)間的關(guān)系

本研究中151例腎透明細(xì)胞癌患者中隨訪(fǎng)成功138例，失訪(fǎng)13例，失訪(fǎng)率8.6%。單因素Cox回歸分析顯示，性別與腫瘤最大徑、WHO/ISUP核分級(jí)、臨床分期、肉瘤樣變、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及CYP4A11、Ki-67水平對(duì)患者總生存時(shí)間有影響。對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行多因素Cox回歸分析顯示，臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為影響腎透明細(xì)胞癌患者總生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表2。

表2 單因素和多因素Cox回歸模型分析腎透明細(xì)胞癌患者總體生存時(shí)間的影響因素

3 討 論

約70%腎透明細(xì)胞癌中VHL基因突變或者高甲基化導(dǎo)致pVHL表達(dá)失活，使得缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)大量增加并激活下游一系列缺氧反應(yīng)基因，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等，誘導(dǎo)血管生成、促進(jìn)糖酵解及脂質(zhì)沉積等，使其具有不同于正常腎小管上皮細(xì)胞的代謝特征。因此，典型腎透明細(xì)胞癌組織富含血管、糖原和脂質(zhì)[9-12]。CYP4A11是CYP家族的主要成員之一，參與脂肪酸分解代謝以及催化20-HETE的形成，在調(diào)節(jié)血管張力、腎血流量和腎小管鈉轉(zhuǎn)運(yùn)等方面發(fā)揮重要作用，并與腫瘤血管生成、增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)[13-19]。CYP4A11基因的啟動(dòng)子區(qū)域中含過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-α(PPARα)反應(yīng)元件，PPARα調(diào)控CYP4A11。既往研究表明，PPARα基因在腎透明細(xì)胞癌、前列腺癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌中均明顯下調(diào)，PPARα蛋白在透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織，而且與生存不良密切相關(guān)，可作為臨床診斷和預(yù)后指標(biāo)[20]。同時(shí)有研究表明，PPARα在高級(jí)別腎透明細(xì)胞癌組織中較低級(jí)別組織中表達(dá)增高[21]。CYP4A11在人體肝中含量最高，其次是腎臟，在其他器官中表達(dá)較低[6]。研究表明CYP4A11在肝癌中表達(dá)水平明顯低于正常組織，且與肝癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)，而CYP4A11在三陰性乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等組織中表達(dá)水平高于正常組織，其代謝產(chǎn)物20-HETE表達(dá)也增加[18，22-25]。20-HETE已被公認(rèn)為是癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與VEGF等共同作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖、新生血管形成、腫瘤生長(zhǎng)以及轉(zhuǎn)移[5,26-27]。CYP4A11參與細(xì)胞脂肪酸代謝，并促進(jìn)非酒精性脂肪肝的形成[28]。本研究結(jié)果顯示，CYP4A11在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，CYP4A11表達(dá)水平的變化提示其受PPARα的調(diào)控，而在腎透明細(xì)胞癌組織當(dāng)中，CYP4A11在高級(jí)別腎透明細(xì)胞癌中的高表達(dá)率顯著高于低級(jí)別腎透明細(xì)胞癌，這可能表明CYP4A11在正常腎小管細(xì)胞和腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的脂肪酸代謝中發(fā)揮不同作用。具體機(jī)制有待于進(jìn)一步探索。本研究評(píng)估CYP4A11在不同組織學(xué)級(jí)別的腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)，分析其表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CYP4A11與患者性別及腫瘤最大徑、臨床分期、肉瘤樣變、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示CYP4A11可能參與腎透明細(xì)胞癌的惡性生物學(xué)行為過(guò)程，并對(duì)患者的生存及預(yù)后具有提示意義。腎透明細(xì)胞癌伴肉瘤樣分化是一種惡性程度更高的類(lèi)型[29]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYP4A11在肉瘤樣區(qū)域中表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)且表達(dá)程度明顯高于周?chē)该骷?xì)胞癌區(qū)域。提示CYP4A11可能參與腎透明細(xì)胞癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(肉瘤樣變)過(guò)程，這有待于進(jìn)一步探索。

目前Ki-67通常被作為細(xì)胞增殖活性的敏感指標(biāo)[2]。本研究結(jié)果顯示，Ki-67在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)程度與腫瘤組織學(xué)級(jí)別、最大徑、臨床分期、肉瘤樣變、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與患者性別、年齡無(wú)關(guān)。Spearman相關(guān)性分析顯示，腎透明細(xì)胞癌組織中CYP4A11與Ki-67表達(dá)呈正相關(guān)。CYP4A11以及Ki-67可以作為預(yù)測(cè)腎透明細(xì)胞癌患者生物學(xué)行為的有效指標(biāo)，對(duì)腎透明細(xì)胞癌的預(yù)后評(píng)估具有指導(dǎo)意義。

本研究單因素分析顯示，性別與腫瘤最大徑、WHO/ISUP核分級(jí)、臨床分期、肉瘤樣變、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及CYP4A11、Ki-67水平對(duì)患者總生存時(shí)間有影響。對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行多因素分析顯示，臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為影響腎透明細(xì)胞癌患者總生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。以上生存分析結(jié)果說(shuō)明腎透明細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移進(jìn)展及預(yù)后不良與CYP4A11及Ki-67表達(dá)程度有關(guān)，兩者在判斷腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后中有潛在的價(jià)值。